AM: 載細胞4D生物打印，實現(xiàn)穩(wěn)定多維結構打印

來源: EngineeringForLife

四維（4D）生物打印有望構建具有復雜幾何形狀和功能的細胞負載生物結構，用于組織/器官再生應用。開發(fā)基于水凝膠的4D生物墨水，特別是能支持活細胞打印、易于制備、成分明確、物理性能可控的4D生物墨水，對于4D生物打印至關重要。開發(fā)了一種不同于傳統(tǒng)顆粒微凝膠的具有非均勻尺寸分布的單組分堵塞微薄片水凝膠（MFH）作為4D載細胞生物打印的新型生物墨水。由于MFH生物墨水具有細胞相容性、可規(guī)模的生產、剪切變稀、剪切屈服和快速自愈的特性，因此可以平滑地打印成穩(wěn)定的3D生物結構，當加入光引發(fā)劑和UV吸收劑時，可以進一步交聯(lián)以形成交聯(lián)密度梯度。經過形狀變形后，獲得了各種結構清晰、細胞活力高的復雜生物結構。在此系統(tǒng)的基礎上，作為概念演示了4D軟骨樣組織的打印，證明這種多功能的新型4D 生物墨水系統(tǒng)的建立可能會在組織工程中開辟許多應用領域。

近期，來自于University of Illinois at Chicago的Eben Alsberg教授在 Advanced Materias雜志上發(fā)表題為：Jammed Micro-Flake Hydrogel for 4D Living Cell Bioprinting的文章，開發(fā)了一種由離子交聯(lián)氧化和甲基丙烯酸海藻酸鹽（OMA）水凝膠組成的非均質單組分微薄片水凝膠（MFH）系統(tǒng)，作為負載細胞4D生物打印的生物墨水，最終實現(xiàn)了穩(wěn)定的多維結構打印。當加入光引發(fā)劑（PI）和UV吸收劑時，進一步交聯(lián)以形成在水凝膠內具有交聯(lián)梯度的更堅固的水凝膠結構。根據(jù)特定的生物組織形狀進行打印，從而獲得具有復雜結構和高細胞活力的生物結構。

原理圖 MFH系統(tǒng)的4D生物打印方案

首先，制備非均質單組分微薄片水凝膠（MFH）,第一步將氧化1%和甲基丙烯酸化30%的海藻酸鹽（OMA）配成濃度為2%的溶液滴入Ca2+溶液（0.2m）中，與鈣離子（Ca2+）完全交聯(lián)形成離子交聯(lián)水凝膠，使用家用攪拌機簡單混合制備成MFH前體；第二步，MFH前體在用含有PI和UV吸收劑的介質清洗并重新組合后，變?yōu)榫哂衅瑺钚螒B(tài)（41.7±19.8μm）的“堵塞狀態(tài)”。這些堵塞的微凝膠在低剪切應變下表現(xiàn)出類似固體的行為。一旦MFH受到增加的剪切速率或大于10%的剪切應變，將就會表現(xiàn)出典型的剪切變薄和剪切屈服行為。重要的是，在接受1%到100%的交替剪切應變時，MFH經歷了快速且可重復的相變，證明了其快速自愈能力。

圖1 （a）番紅O染色MFHs的顯微照片.（b）示意圖顯示了顆粒微凝膠的較低堆積密度（上）和較高堆積不規(guī)則MFH（下）.（c）MFHs微凝膠儲能模量和損耗模量作為頻率的函數(shù)（d）剪切速率和（e）超過10%應變的剪切應變.（f）隨著剪切應變的增加，G“和G”交叉，表明剪切屈服。通過在1%和100%之間交替施加應變，快速恢復MFHs（g）模量和（h）粘度.（i）通過22號（22G）針（內徑413μm）打印的燈絲顯微照片。3D打印（j）水凝膠條（25×4×1 mm3）和（k）水凝膠長方體（10×8×6 mm3）的照片.

為了研究4D結構的形狀變形行為，使用22G針以80%填充密度和4mm/s打印速度打印24 × 4 × 0.6 mm3水凝膠條，在整個厚度上具有梯度交聯(lián)密度，產生彎曲角度的變形取決于結構尺寸、印刷參數(shù)、UV交聯(lián)時間以及培養(yǎng)基。水凝膠條在三種介質（即去離子水（diH2O，S3）、PBS（pH 7.4）和細胞生長介質（GM））中彎曲到高交聯(lián)側，形成封閉或開放的水凝膠環(huán)，彎曲角度的顯著變化是由水凝膠條在各自介質中的溶脹差異引起的。探究了填充密度、打印速度、針頭的尺寸等打印參數(shù)以及不同的紫外線照射時間對彎曲角度的影響。此外，彎曲角度隨水凝膠條的長度增加而增加，但不隨寬度變化。

圖2 水凝膠條在不同孵育溶液中或在不同參數(shù)下的4D形狀變形行為

除了可編程變形外，還可以應用外部刺激變形，根據(jù)需要進一步操縱印刷結構的形狀，為了證明通過外部刺激控制MFH結構形狀變化的能力，研究了單組分單層梯度交聯(lián)水凝膠條僅在pH刺激下的多個形狀轉變。

圖3 視頻快照顯示了在室溫下，水凝膠條在不同pH處理下的形狀變化

為了證明將堵塞的MFH用作4D活細胞生物打印的細胞負載生物墨水的可行性，將成纖維細胞系（NIH3T3）、癌細胞系（HeLa）、原代干細胞（人骨髓間充質干細胞，hMSCs）分別與含有PI和UV吸收劑的MFH混合，打印水凝膠條，然后在GM中培養(yǎng)以研究產生的形狀變化。在所有情況下，含細胞的水凝膠條顯示出與無細胞相當?shù)膹澢�度，培養(yǎng)24小時后仍保持高度活性。受此啟發(fā)，通過將梯度交聯(lián)形成與基于掩模的光刻或復雜的生物打印幾何設計相結合，來制造具有更復雜的各種生物結構。

圖4 （a）MFH梯度水凝膠棒的彎曲行為，有無嵌入細胞。插圖顯示了彎曲水凝膠條的代表性顯微照片.（b）裝載NIH3T3的MFH結構的顯微照片.（c）梯度水凝膠條中NIH3T3成纖維細胞的代表性活/死圖像。（d） 裝載細胞的“生物螺旋”結構的顯微照片.（e）一個充滿細胞的“bioS”結構的照片.（f）充滿細胞的“偽四瓣”和（g）充滿細胞的“偽六瓣”花的照片.插圖照片顯示了相應的打印結構。Kirigamibase結構和變形形態(tài)：水凝膠呈條狀網(wǎng)格模式（h），沒有和（i）具有內部水平條

目前，所有之前的4D生物打印工作僅呈現(xiàn)2D和/或2.5D的形狀變換成3D結構，在z方向上有一定的附加）。據(jù)我們所知，通過4D生物打印或任何其他方法實現(xiàn)的細胞相容性生物材料與包裹細胞的3D到3D形狀變形尚未見報道。MFH系統(tǒng)可以用3D打印出獨立的各向異性結構，因此可以以可控的方式實現(xiàn)單個打印中制作的結構形狀的轉換，如“柱狀夾持器”和“魚翅片”很容易打印出來，然后通過控制光照射方向和暴露于光的區(qū)域，在兩種代表性3D結構中創(chuàng)建多個位置特異性交聯(lián)梯度。

圖5 三維到三維形狀變形的演示

為了在組織工程應用中利用這種形狀變形策略，4D細胞負載結構能夠和/或驅動封裝細胞分化以及新組織的形成和成熟非常重要。4D生物打印MFH系統(tǒng)能夠制造復雜的生物結構，同時促進功能組織的工程化。4D生物打印含hMSC的MFHs水凝膠條加入軟骨形成介質（CM）中培養(yǎng)，以誘導形成具有相對預定義最終構型的軟骨樣組織。在21天的過程中，持續(xù)監(jiān)測負載 hMSC水凝膠條的軟骨形成及其形狀變化。最初的直梯度水凝膠條在2小時內彎曲成“C”形，彎曲水凝膠條的形狀在軟骨形成過程中變化很小，表明4D生物結構具有良好的穩(wěn)定性，為了量化軟骨形成，分析了DNA水平和主要軟骨細胞外基質成分糖胺聚糖（GAG）。隨著時間的推移，DNA含量表現(xiàn)出相對穩(wěn)定的水平，GAG產量穩(wěn)步增加。

圖6 基于MFH的4D生物打印技術在組織工程中的應用

總之，這種新的單組分非均勻尺寸分布的堵塞MFH系統(tǒng)被開發(fā)用于4D活細胞生物打印的載細胞生物墨水，新型生物墨水顯示出理想的剪切變稀、剪切屈服和快速自愈特性，并在沒有支撐浴的情況下以高分辨率和高保真度直接沉積各種3D生物結構，在生理條件下實現(xiàn)4D形狀變化，水凝膠內有效生成交聯(lián)梯度后維持高細胞活力。最終，概念證明4D軟骨樣組織在彎曲的水凝膠條和折疊的四瓣和六瓣花中形成，這種獨特的4D生物打印系統(tǒng)將在4D組織和器官工程中有很好的應用前景，并可能有助于研究發(fā)育過程。

文章來源：
https://doi.org/10.1002/adma.202109394