基于載微球的絲素蛋白墨水3D打印構建具有氧氣釋放和免疫調控功能的血管化心肌補片

來源：生物打印與再生工程  

急性心肌梗塞發(fā)生之后,，受損的心肌組織失去心肌細胞并形成纖維疤痕組織,，這會加重局部健康心肌細胞的負荷,，進一步損壞心肌功能。目前,，由組織工程技術構建的心肌補片是一種具有潛力心肌修復工具,。理想的心肌補片應當具有與心肌組織相匹配的力學特性和導電性，同時要有良好的生物相容性,。

印度理工學院瓜哈提分校生物科學工程系的Biman B. Mandal等人在ACS Materials and Interfaces雜志發(fā)表了題為“Engineering Microsphere-Loaded Non-mulberry Silk-Based 3D Bioprinted Vascularized Cardiac Patches with Oxygen-Releasing and Immunomodulatory Potential”的文章,。研究者使用絲基生物墨水封裝內皮細胞，打印了血管化組織工程支架,，通過摻雜碳納米管使其具備了一定導電性,。之后在支架內種植心肌細胞，灌注裝載白細胞介素-10(IL-10)的明膠甲基丙烯�,；�微球和過氧化鈣,，從而保證補片植入后局部的微環(huán)境中有足夠氧氣促進心肌細胞和內皮細胞的存活，同時釋放出的 IL-10因子可以使原位巨噬細胞極化為抗炎M2表型,，改善其植入后的免疫反應,。

背景介紹
近年來，使用組織工程技術制造的功能化心肌補片已經逐漸顯示出了臨床應用價值,，另一方面,，生物3D打印技術也為構建復雜的異質微環(huán)境提供新的方法,。研究者基于已報道的部分工作，使用包含非桑蠶絲素蛋白 (nSF),、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯 (PEGDMA) 和 GelMA 聚合物 (SPG) 的生物墨水封裝內皮細胞,，通過3D打印技術制備了各向異性的血管化心肌組織補片，并通過摻雜碳納米管 (CNT)改善補片中心肌細胞電生理信號的傳導,。該補片經過一定時間灌注培養(yǎng)后植入了新生大鼠心肌細胞,，最終使其成為具有天然組織排布且能夠同步收縮的心肌補片。

為了能夠使補片在植入宿主體內后快速整合,，增強局部的細胞活力并改善組織功能,，減小損傷和炎癥反應。研究人員進一步將帶有過氧化鈣和白細胞介素-10的GelMA微球加入了心肌補片之中,，這樣緩釋出的氧氣有助于改善植入后內皮細胞和心肌細胞的活力,，同時IL-10因子也可以減小炎癥反應。

實驗方法與結果
1.導電生物墨水
該生物墨水主要由非蠶絲來源的絲素蛋白,、PEGDMA,、GelMA混合而成。通過超聲分散3mg/ml 碳納米管增強其導電性,，在添加了光引發(fā)劑之后就可通過紫外固化成型,。同時墨水內還添加了10 mM HRP 和 0.9% v/v H 2 O 2，用于分散以及形成微纖維結構,。墨水中PEGDMA可以改善其打印時穩(wěn)定性,，同時GelMA具有不錯的生物相容性。

圖1 導電墨水具有剪切變稀的流變特性,，使用3D打印設備預成型后通過紫外光進行交聯(lián),。

2.預血管化補片的制備與表征
該支架通過使用生物3D打印的方式進行制造，通過設計每一層不同的絲間距,，形成了以三層為一個單元的籠形支架結構,。該支架結構與心肌纖維的結構相似，且力學特性與心肌組織的細胞外基質相似,。將直流電通過樣品來評估 3D 打印結構的電導率,， 與不摻雜CNT的生物材料墨水 ( R = 129.7 ± 4.37 kΩ) 相比，摻雜后( R = 93.6 ± 7.3 kΩ) 的電阻值較低,，表明在生物墨水中添加 CNT 后電導率增加,。

圖2 支架整體呈各向異性，摻雜CNT之后其電導率明顯提升,。

使用封裝有內皮細胞的生物墨水進行生物3D打印,，之后放入特定的生物反應器以4 μl /min的流速灌注培養(yǎng)基。在灌注微生物反應器中成熟后第 14 天對內皮細胞進行免疫染色,，可以看到內皮細胞之間連接緊密,。定量檢測顯示其DNA含量增加了4.2倍,。

圖3 使用封裝有內皮細胞的生物墨水打印支架，灌流的模擬如圖C所示,，灌流十四天后使用熒光免疫染色觀察細胞形態(tài),。

3.心肌細胞植入、電刺激訓練及表征
將新生大鼠原代心肌細胞接種到放置在疏水性 PDMS 表面上的生物打印支架上,，通過DNA定量檢測評估細胞狀態(tài),。對比不摻雜CNT的生物支架，該生物支架的DNA相對較少,，研究人員推測是CNT抑制了成纖維細胞的增殖,。通過對F-肌動蛋白染色，可以看到心肌細胞沿著各向異性的微纖維結構均勻分布,。

圖4 支架植入心肌細胞后的生物學表征,，免疫熒光染色結果顯示，導電支架上心肌細胞特異性標志物含量更高,。

研究人員還使用特定的電刺激裝置對該結構進行了1Hz的電刺激訓練，七天后對心臟特異性標志物連接蛋白,、原肌球蛋白和 F-肌動蛋白 ( n = 6) 進行免疫染色,，用于評估心肌組織的功能性。結果顯示摻雜CNT的支架中,，細胞的跳動頻率更高且跳動更加均勻,，并且經過電刺激訓練后的心肌細胞跳動頻率也有更進一步提升。

圖5 支架內心肌組織的功能性評估,，相比對照組,，導電支架上心肌的跳動頻率更高且均勻。

4.氧氣及IL-10因子緩釋
為了改善該補片植入后的效果,，研究人員使用微流控技術將過氧化鈣封裝在約200-250 μm的GelMA微球中,，與空白組相比，微球可以在起初的4-5天維持局部的富氧環(huán)境,。微球制備使用特制的同軸噴頭,，具體參數如下：
外相：杏仁油，流速為 2500 μL/min,；
內相：7.5% w/v CPO-GelMA,、1% w/v LAP，流速50 μL/min,；
光源：405 nm,，1000 mW；
光照時間：20s,。

圖6 緩釋微球的制備流程,，如（B）中所示,，微球中在前五天內穩(wěn)定釋放氧氣。

IL-10-GelMA微球制作工藝與CPO-GelMA相似,，使用上述微流控參數,，內相為7.5% w/v GelMA、1% w/v LAP,。制得微球后凍干,，與 IL-10 溶液在4℃下孵育24 h。將帶有 IL-10因子的微球與巨噬細胞共培養(yǎng),，可以看出帶有IL-10因子的GelMA微球可以明顯促進巨噬細胞向M2表型極化,，這意味著可以明顯降低局部的促炎因子分泌。

圖7  IL-10-GelMA 微球對人類巨噬細胞有免疫調節(jié)作用,，免疫染色結果表明其釋放的IL-10可以促進巨噬細胞極化為 M2 表型,。

總結
該研究使用了多種組織工程技術，通過生物3D打印制造籠形導電心肌支架,，在生物反應器內灌注促進內皮形成血管化結構,，之后電刺激誘導支架內心肌細胞成熟，隨后在支架內放入由微流控裝置制造的藥物緩釋微膠囊,，構建出一種集導電,、載細胞、藥物/氧氣緩釋于一體的血管化心肌補片材料,。

參考文獻：
Shreya Mehrotra, Rishabh Deo Singh, et al. Engineering Microsphere-Loaded Non-mulberry Silk-Based 3D Bioprinted Vascularized Cardiac Patches with Oxygen-Releasing and Immunomodulatory Potential. ACS Appl. Mater. Interfaces 2021, 13, 43, 50744–50759
https://doi.org/10.1021/acsami.1c14118