浙江大學(xué)王毅及賀永團(tuán)隊(duì)：生物水凝膠微結(jié)構(gòu)快速制造方法助力心肌細(xì)胞定向可控生長(zhǎng)

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生物水凝膠上的微/納米結(jié)構(gòu)廣泛用于誘導(dǎo)細(xì)胞圖案化,。傳統(tǒng)的光刻技術(shù)制造模具既耗時(shí)又昂貴,，并且由于生物水凝膠軟脆的特性，過(guò)大的脫模力還極易導(dǎo)致微結(jié)構(gòu)損壞。近期,，EFL團(tuán)隊(duì)與藥學(xué)院王毅教授合作提出了一種快速批量制造細(xì)胞圖案的新方法,，使用高精度3D打印模具，通過(guò)揭示熱-光交聯(lián)固化機(jī)制,，實(shí)現(xiàn)低濃度-低取代率的GelMA水凝膠微結(jié)構(gòu)高質(zhì)高效制造,。利用該方法，可以穩(wěn)定且低成本地制造特征尺寸為6-80μm任意定制的水凝膠圖案,。在超軟水凝膠及高精度微結(jié)構(gòu)的支持下,，心肌細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)每分鐘216次（BPM）的持續(xù)自發(fā)搏動(dòng)，接近大鼠心臟的自然搏動(dòng)速率（300 BPM）,。這項(xiàng)工作為細(xì)胞圖案化提供了一個(gè)通用方案,，能廣泛應(yīng)用于組織修復(fù)、藥物測(cè)試篩選等領(lǐng)域,。相關(guān)工作“Rapid and mass manufacturing of soft hydrogel microstructures for cell patterns assisted by 3D printing”近期發(fā)表在Bio-Design and Manufacturing雜志上,，浙大機(jī)械學(xué)院何超凡博士生與浙大藥學(xué)院王雪純博士為共同一作，浙大機(jī)械學(xué)院的賀永教授和藥學(xué)院的王毅教授為共同通訊作者,。

材料與細(xì)胞的相互作用是組織工程和再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一,。除了生化特性，材料表面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞行為也有重要影響,。許多研究表明,，接近細(xì)胞大小的微/納米結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞具有“接觸引導(dǎo)”效應(yīng)，即細(xì)胞的生長(zhǎng)方向與該結(jié)構(gòu)趨于一致,，這一效應(yīng)已在許多細(xì)胞中得到驗(yàn)證,。然而，現(xiàn)有的細(xì)胞-基質(zhì)相互作用研究大多基于生物相容性較差的材料,，如聚二甲基硅氧烷（PDMS）,、硅、石英等,，其主要原因是高效高質(zhì)制造軟脆水凝膠微結(jié)構(gòu)仍然是一個(gè)很大的挑戰(zhàn),，低濃度-低取代率的水凝膠更是如此。本文采用高精度DLP打印工藝制造了超精密結(jié)構(gòu)的模具,，并翻模出軟的PDMS模具,，與光刻技術(shù)相比設(shè)計(jì)靈活性及效率有較大提升。將GelMA溶液澆鑄在模具上進(jìn)行熱-光交聯(lián),，與光交聯(lián)GelMA (PGelMA)相比,，熱光交聯(lián)GelMA (TPGelMA)在保持良好的生物相容性、降解性和可調(diào)性的同時(shí),，更有彈性,。其核心的機(jī)制是隨著溫度的降低,，三螺旋結(jié)構(gòu)（THS）的部分恢復(fù)會(huì)導(dǎo)致GelMA的溶液-凝膠化轉(zhuǎn)變。熱光交聯(lián)的凝膠TPGelMA,，其力學(xué)性能的提高能大幅降低脫模過(guò)程中微結(jié)構(gòu)的破壞,。

圖1 軟脆水凝膠微結(jié)構(gòu)制造方法

為驗(yàn)證三螺旋結(jié)構(gòu)（THS）對(duì)GelMA水凝膠性能的影響，比較了EFL-GM30,、GM60,、GM90三種典型取代率GelMA的CD光譜。這三條線在198 nm附近都有一個(gè)負(fù)峰,，與膠原蛋白類似,。峰幅值隨著取代率的增加而減小，說(shuō)明MA基團(tuán)的引入破壞了明膠鏈上原有的氨基酸序列,，阻礙了THS的形成,。GM30在不同溫度下的CD光譜也顯示，隨著溫度的降低,，促進(jìn)了THS的形成,。FTIR分析顯示，TPGelMA光譜的峰值更高,，頻率也發(fā)生了顯著變化,，這與氫鍵數(shù)量的增加密切相關(guān)。在機(jī)械強(qiáng)度方面,，TPGelMA的楊氏模量和抗拉強(qiáng)度均明顯高于PGelMA,。隨著取代率的增加，強(qiáng)度增加比逐漸降低,，說(shuō)明MA基團(tuán)的引入阻礙了THS的形成,，這與CD光譜的結(jié)果一致。兩種GelMA在不同溶劑中的體積變化率也不同,。結(jié)果表明,，TPGelMA在去離子水、PBS溶液和75%乙醇溶液中的體積變化明顯小于PGelMA,，表明TPGelMA的分子網(wǎng)絡(luò)更致密,。

圖2 熱-光交聯(lián)水凝膠的性能

水凝膠潮濕、軟脆的特性使其力學(xué)數(shù)據(jù)難以準(zhǔn)確測(cè)量,。到目前為止,，對(duì)水凝膠力學(xué)性能的研究大多僅限于壓縮試驗(yàn)上。為解決這一問(wèn)題,，我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)方案，以準(zhǔn)確獲取水凝膠拉伸,、壓縮,、剪切,、黏附等各種力學(xué)數(shù)據(jù)。并在此基礎(chǔ)上,，建立了水凝膠在脫模過(guò)程中的粘附和損傷模型,。拉伸試驗(yàn)結(jié)果表明，TPGelMA的楊氏模量,、抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率顯著提高,。當(dāng)應(yīng)變達(dá)到200%后，應(yīng)力-應(yīng)變曲線斜率明顯增大,，為“應(yīng)變硬化”效應(yīng),。這種現(xiàn)象并沒(méi)有發(fā)生在PGelMA中。在整個(gè)拉伸過(guò)程中,，PGelMA的應(yīng)力-應(yīng)變曲線始終是線性的,。這可能是因?yàn)槠浞肿泳W(wǎng)絡(luò)比較松散，在分子鏈取向趨于一致之前就斷裂了,。在剪切實(shí)驗(yàn)中,，TPGelMA也表現(xiàn)出更好的力學(xué)性能。而在粘附實(shí)驗(yàn)中,，TPGelMA的粘附強(qiáng)度雖然也有所增加,，但增加幅度遠(yuǎn)低于拉伸和剪切強(qiáng)度的增加幅度，這也是TPGelMA能避免脫模損傷的重要原因,。

圖3 水凝膠機(jī)械性能測(cè)試方案與損傷模型

我們?cè)O(shè)計(jì)了平行凹槽,、封閉圓環(huán)、曲線,、分叉血管和10um-5mm的跨尺度結(jié)構(gòu)以驗(yàn)證制備方案的可行性,。結(jié)果表明TPGelMA的制作完整，而PGelMA上的微結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重,，難以分辨,。在一個(gè)PDMS模具上反復(fù)多次脫模后模具上沒(méi)有殘留。因此,，該方案脫模后無(wú)需清洗,，大大縮短了工藝流程。為了對(duì)工藝窗口進(jìn)行全面分析,，選擇力學(xué)性能依次提高但生物性能降低的GM30 ~ GM5M進(jìn)行脫模試驗(yàn),。結(jié)果表明，TPGelMA在最低濃度,，結(jié)構(gòu)復(fù)雜度,，深寬比三個(gè)方面的工作窗口都明顯拓寬。

圖4 水凝膠微結(jié)構(gòu)的制造

熱光交聯(lián)可以最大程度地保持明膠基水凝膠的生物相容性,，同時(shí)提高其機(jī)械強(qiáng)度,。這是因?yàn)槟z原蛋白分子鏈上的細(xì)胞粘附位點(diǎn)沒(méi)有被破壞,。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，將心肌細(xì)胞,、肌腱干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞接種于PGelMA和TPGelMA上,，并在第3天進(jìn)行活死分析。結(jié)果表明,，不同的細(xì)胞對(duì)兩種水凝膠均有良好的生物活性,。為了驗(yàn)證微圖紋水凝膠對(duì)細(xì)胞的接觸引導(dǎo)作用，用肌腱干細(xì)胞構(gòu)建了平行條紋圖,，用心肌細(xì)胞構(gòu)建了環(huán)形圖,。可以看到細(xì)胞按照設(shè)計(jì)的圖案排列,，細(xì)胞骨架也沿著微結(jié)構(gòu)的方向生長(zhǎng),。而脫模失敗的水凝膠則很難使細(xì)胞形成圖案。

圖5 生物相容性和細(xì)胞圖案化效果

在水凝膠上的細(xì)胞圖案更符合體內(nèi)微環(huán)境,。分析心肌細(xì)胞的跳動(dòng)及功能蛋白表達(dá),。對(duì)照組心肌細(xì)胞無(wú)序生長(zhǎng)，隨機(jī)分布,，細(xì)胞之間的連接也非�,；靵y。相比之下,，實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞排列更有規(guī)律,，掃描電子顯微鏡也清楚地顯示，細(xì)胞連接形成一個(gè)更有序的網(wǎng)絡(luò),。利用視頻分析軟件ImageJ對(duì)心肌細(xì)胞的跳動(dòng)進(jìn)行分析,，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的跳動(dòng)速度為24 BPM，比機(jī)體的跳動(dòng)速度慢一個(gè)數(shù)量級(jí),。實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞的搏動(dòng)速度為216 BPM,。實(shí)驗(yàn)組不僅細(xì)胞的搏動(dòng)速度提高了10倍，而且搏動(dòng)一致性提高了很多,。對(duì)照組細(xì)胞收縮時(shí)間,、峰-峰時(shí)間、峰間時(shí)間,、松弛時(shí)間更長(zhǎng),。而且數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差很大，說(shuō)明細(xì)胞跳動(dòng)的規(guī)律性很差,。在實(shí)驗(yàn)組中,，細(xì)胞跳動(dòng)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差降低為十分之一左右。這表明,，細(xì)胞不僅跳動(dòng)得更快,，而且跳動(dòng)得更有規(guī)律,。肌節(jié)α肌動(dòng)蛋白染色分析顯示，圖案化心肌細(xì)胞具有肌節(jié)結(jié)構(gòu),，隨細(xì)胞縱向分布，這更符合生物體的實(shí)際情況,。相比之下,，對(duì)照組的肌動(dòng)蛋白是無(wú)序的。這表明圖案心肌細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上更接近生物體的真實(shí)狀態(tài),，對(duì)理解細(xì)胞行為和構(gòu)建人工生物組織具有重要的啟發(fā)意義,。軟脆水凝膠微結(jié)構(gòu)制備方法在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的潛力，為仿生組織,、芯片上器官,、細(xì)胞行為學(xué)和微流體提供了一個(gè)通用的平臺(tái)。

圖6 圖案化細(xì)胞的功能性

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https://link.springer.com/article/10.1007/s42242-022-00207-1