脫細胞基質(zhì)水凝膠的生物制造技術(shù)及其應用

來源：生物打印與再生工程

脫細胞基質(zhì)（Decellularized matrix，dECM）水凝膠是一種具有與天然組織器官近似復雜生化信號分子的親水三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu),，被認為是組織器官修復/制造的理想材料。其主要成分包括蛋白質(zhì),、糖胺聚糖,、蛋白聚糖等，可以支持細胞3D培養(yǎng),、提供生化物理信號并與細胞動態(tài)互惠,。近年來,，該材料的成型加工是研究的熱點之一，本專題主要總結(jié)了脫細胞基質(zhì)在低維和三維結(jié)構(gòu)的生物制造手技術(shù)與應用,。

一,、dECM的低維結(jié)構(gòu)制造
研究表明dECM可為細胞重建組織特異性的細胞微環(huán)境，促進細胞功能成熟,，因此常作為提高細胞生物相容性,、調(diào)節(jié)細胞行為的功能性材料在低維結(jié)構(gòu)中發(fā)揮重要作用。

1. Journal of Materials Chemistry B 2018：dECM涂層技術(shù)【1】
簡介：
韓國浦項科技大學Dong-woo cho教授團隊將豬脛骨前肌組織經(jīng)1%十二烷基硫酸鈉（SDS）,、50U/ml DNAse、1U/ml RNAse和0.5%Triton X-100處理后制備得到肌肉脫細胞基質(zhì)（mdECM）,，并溶解于含胃蛋白酶的0.5M醋酸中得到水凝膠前體（Pre-gel）,。Pre-gel經(jīng)中和后涂敷在由X射線LIGA技術(shù)制造的正弦波狀（20、40,、80mm）聚苯乙烯結(jié)構(gòu)表面形成凝膠涂層,，種植小鼠C2C12細胞培養(yǎng)7天后，評估肌管的形成情況,。結(jié)果顯示間距為80mm的正弦波狀表面上觀察到排列良好的肌管,，并接近天然肌纖維的寬度（~100 mm）。dECM涂層表面細胞粘附,、細胞活力,、肌管形成和肌源性基因表達（提高1.5-2倍）水平顯著高與膠原蛋白涂層。

2.  Composites Part B: Engineering 2022：dECM靜電紡絲膜制造技術(shù)【2】
簡介：
由于骨膜脫細胞基質(zhì)（pdECM）的形狀,、完整性,、均勻性和尺寸的控制難度較高，不能為臨床骨缺損修復提供適合的治療,�,；�于此，廣東省人民醫(yī)院口腔科周苗教授團隊把pdECM粉末溶解在六氟異丙醇中,，利用同軸靜電紡絲將聚己內(nèi)酯（PCL）/pdECM復合制備出具有骨膜特異性生化信號分子和定制物理化學特性的組織工程骨膜（TEP）以促進骨缺損愈合,。結(jié)果表明TEP具有良好的生物降解率，可避免感染,、重建失敗和影響新生組織長入等問題,。與純PCL相比，TEP可促進hBMDCs的增殖,、基質(zhì)成熟及成骨分化,。與純ECM相比，PCL核心可提供TEP較好的機械強度促進細胞的成骨分化并延長降解速率,。

3. Macromolecular Bioscience 2022：dECM噴霧技術(shù)【3】
簡介：
安卡拉大學Burak Derkus教授團隊利用噴霧技術(shù)將骨脫細胞基質(zhì)（bdECM）水凝膠前體溶液噴涂在聚己二酸/對苯二甲酸丁二醇酯（PBAT）電紡膜上,，置37℃孵育1h后取出電紡膜并清理多余的dECM材料,。將人胎兒成骨細胞（hFOBs）種植在電紡膜表面，觀察細胞行為,。結(jié)果顯示纖維定向排布并且噴涂dECM的PBAT電紡膜表面hFOBs的骨相關(guān)基因表達上調(diào),。

二、dECM的三維結(jié)構(gòu)制造
目前生物3D打印技術(shù)是dECM三維結(jié)構(gòu)制造的主流方式,，以宏觀構(gòu)建仿生組織器官,。但由于dECM凝膠時間長且成膠后機械性能較差，研究人員在3D打印過程中通過制造裝置改進,、制造工藝優(yōu)化,、制造原料加工等方式提高了dECM的打印性和打印后的形狀保真度。

1. 制造裝置改進
（1）Scientific Reports 2017【4】：改進3D打印機加熱裝置
簡介：
韓國理工大學Jin-Hyung Shim教授團隊開發(fā)了一種帶雙重加熱模塊的3D細胞打印系統(tǒng),，用于實時加熱交聯(lián)皮膚dECM（sdECM）生物墨水,，實驗表明sdECM水凝膠的黏度、模量及可打印性隨濃度的提高而增加,，而水凝膠孔隙大小與細胞活力隨濃度升高而降低,。當噴頭和底板同時加熱，sdECM的打印性顯著提高,，其中2%sdECM與2.5%sdECM的形狀保真度無顯著性差異,，且同時加熱打印得到的3D結(jié)構(gòu)機械性能優(yōu)于其他組。但長期加熱打印會導致墨水干燥,，會嚴重影響細胞活性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,。

（2）Macromolecular Bioscience 2018【5】：預升溫dECM交聯(lián)后打印
簡介：
薩班奇大學Bahattin Koc教授團隊開發(fā)了牛跟腱dECM生物墨水，對比了不同增溶時間對dECM水凝膠模量,、黏度的影響,。打印時先將dECM水凝膠置37℃預熱6分鐘，然后采用微毛細管移取dECM水凝膠進行擠出打印,，打印過程中無任何支持結(jié)構(gòu)和/或額外的交聯(lián)劑,。該方法打印出的dECM微絲形狀保真度較好，但層與層之間可能存在打印滯后及連接強度等問題,。

2. 制造工藝優(yōu)化
（1）Advanced Science 2019【6】：以海藻酸鈉/黃原膠/葡萄糖內(nèi)酯材料為懸浮體系
簡介：
特拉維夫大學Tal Dvir教授團隊將患者大網(wǎng)膜組織制備成dECM生物墨水,，但在打印尺寸較大、復雜度較高的結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)dECM水凝膠弱機械性能難以支撐其重量,，因此選用懸浮膠支撐dECM的3D結(jié)構(gòu),，該懸浮膠主要由黃原膠和海藻酸鈉微粒組成，且內(nèi)部添加培養(yǎng)基,。作為概念驗證,，他們設計了帶主要血管的心臟簡易結(jié)構(gòu)，打印出的心臟結(jié)構(gòu)完整性較好,，可灌注,，機械性能與脫細胞小鼠心臟無顯著性差異,，打印結(jié)構(gòu)切片染色顯示心肌結(jié)構(gòu)及血管結(jié)構(gòu)內(nèi)部均勻分布心肌細胞與內(nèi)皮細胞。

（2）Bioactive Materials 2022【7】：熱塑性材料支撐dECM打印成形
簡介：
韓國浦項科技大學Dong-woo cho教授團隊利用3D細胞打印和骨/肌腱dECM生物墨水模擬肌腱-骨界面（TBI）制備了梯度多組織界面構(gòu)建物,。這些界面構(gòu)建物在結(jié)構(gòu),、成分和細胞異質(zhì)性方面具有與天然TBI相似的梯度特征。打印時先成形PCL/PU聚合物支架,，后將dECM生物墨水選擇性沉積在聚合物支架表面,，逐層打印獲得8*3*1mm3的尺寸結(jié)構(gòu)，然后進行體內(nèi)外性能評估,。實驗結(jié)果表面該界面構(gòu)建物在重建梯度界面和肩關(guān)節(jié)功能恢復方面具有優(yōu)勢,，具有功能性肩袖再生的應用前景。

3. 制造原料加工
（1）Biomaterials 2016【8】：直接加工——核黃素修飾
簡介：
無顯著性差異,，打印結(jié)構(gòu)切片染色顯示心肌結(jié)構(gòu)及血管結(jié)構(gòu)內(nèi)部均勻分布心肌細胞與內(nèi)皮細胞,。韓國浦項科技大學Dong-woo cho教授團隊開發(fā)了兩步法，使用維生素B2誘導的UVA交聯(lián)和熱凝膠固化心肌dECM生物墨水,，使dECM 3D打印生物結(jié)構(gòu)成為可能。打印的生物結(jié)構(gòu)內(nèi)部細胞活力較高和且心臟祖細胞在內(nèi)部可增殖分化,。



（2）Biofabrication 2021【9】：直接加工——甲基丙烯酸化修飾
簡介：
俄勒岡健康與科學大學Luiz E Bertassoni副教授團隊合成了一種可光交聯(lián)的人骨源性dECM水凝膠,，以用于血管化支架的生物打印。他們將人骨碎片脫礦和脫細胞,，獲得骨dECM水凝膠前體,，用甲基丙烯酸酐進一步處理修飾，獲得光交聯(lián)甲基丙烯酸化骨dECM水凝膠生物材料（BoneMA）,。BoneMA具有可調(diào)諧的力學性能,，其彈性模量隨著光交聯(lián)時間的增加而增加，同時保留了聚合物網(wǎng)絡的納米尺寸特征,。3D打印的BoneMA支架支持內(nèi)皮細胞的血管化,，并在一天內(nèi)形成相互連接的血管網(wǎng)絡。此外,，他們利用數(shù)字光處理（DLP）打印技術(shù)展示了BoneMA在微尺度的可打印性,。

（3）Advanced Functional Materials 2021【10】：直接加工——釕/過硫酸鈉修飾
簡介：
韓國浦項科技大學Jinah Jang助理教授團隊介紹了新型含釕/過硫酸鈉（dERS）的光固化dECM生物墨水。利用dECM內(nèi)含豐富的酪氨酸殘基的優(yōu)勢,，使其在可見光范圍（400-450nm）實現(xiàn)快速交聯(lián),，該光引發(fā)劑的使用濃度低，可防止紫外光誘導的細胞內(nèi)DNA損傷,，高滲透效率也有利于大尺寸結(jié)構(gòu)的整體固化,。該光固化體系在dECM生物墨水中具有巨大應用潛力，有效提高dECM生物墨水的打印精度和形狀保真度,。

（4）Polymers 2019【10】：間接加工——混合甲基丙烯酸化聚氨酯
簡介：
中國醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院3D打印醫(yī)學研究中心謝明佑助理教授團隊利用DLP技術(shù)制備了聚氨酯/聚多巴胺/細胞外基質(zhì)（PU/PDA/dECM）神經(jīng)導管,，并評估了其物理特性,、生物降解性、細胞相容性,、神經(jīng)相關(guān)生長因子,、蛋白的分泌和表達，以及其在允許細胞粘附和增殖方面的潛力,。結(jié)果表明,，PU/PDA/dECM神經(jīng)導管具有更強的親水性，可促進細胞粘附,、增殖,、表達和分泌神經(jīng)相關(guān)蛋白（I型膠原和層粘連蛋白），也可以增強神經(jīng)源性蛋白的表達,，如巢蛋白和微管相關(guān)蛋白2（MAP2）,。此外，PU/PDA/ECM神經(jīng)導管無細胞毒性,，具有持續(xù)的生物降解性,，并具有與PU導管相似的物理特性。因此,，PU/PDA/ECM神經(jīng)導管可能成為未來神經(jīng)相關(guān)研究或臨床應用的潛在候選材料,。

（5）Applied Physics Reviews 2019【11】：間接加工——海藻酸鈉/普朗尼克
簡介：
韓國浦項科技大學Dong-woo cho教授團隊利用血管來源dECM生物墨水和儲蓄庫輔助的三同軸細胞打印技術(shù)構(gòu)建了血管移植物，該移植物尺寸大小與冠狀動脈相似,，并含有異質(zhì)細胞分布,，制備后移植入大鼠腹主動脈處探究其作為人工血管的可行性，結(jié)果表明所有植入物均顯示出良好的通暢度,、完整的內(nèi)皮層,、重塑的平滑肌和與宿主組織高匹配度。

（6）Acta Biomaterialia 2021【12】：間接加工——明膠/透明質(zhì)酸/甘油輔助成型
簡介：
維克森林大學再生醫(yī)學研究所Sang Jin Lee教授團隊分離豬耳廓軟骨組織并進行脫細胞處理,，隨后利用甲基丙烯酸酐（cdECMMA）加工成光交聯(lián)水凝膠,，并與明膠/透明質(zhì)酸/甘油混合提高其打印性，最后與軟骨細胞混合以創(chuàng)建生物墨水,。結(jié)果表明該混合生物墨水打印后的3D結(jié)構(gòu)具有足夠的力學性能和結(jié)構(gòu)完整性,，并且耳廓軟骨細胞保持了活力、增殖能力且產(chǎn)生軟骨ECM成分,，包括膠原蛋白和糖胺聚糖（GAGs）,。

（7）Biomaterials 2022【13】：間接加工——PVA輔助產(chǎn)生對齊/定向纖維
簡介：
維克森林大學再生醫(yī)學研究所Geun Hyung Kim教授團隊使用了脫細胞外基質(zhì)（dECM）作為誘導細胞生化組分，并改進3D細胞打印過程,，利用PVA輔助產(chǎn)生單軸對齊/定向纖維結(jié)構(gòu),。打印結(jié)構(gòu)中的成肌細胞與形成的肌管結(jié)構(gòu)高度對齊，與基于甲基丙烯酸明膠（GelMA）的結(jié)構(gòu)相比,， dECM結(jié)構(gòu)內(nèi)基因表達水平增加了約1.5-1.8倍,。

總結(jié)與展望
目前,，脫細胞基質(zhì)水凝膠已經(jīng)過I期臨床實驗證明其生物安全性良好【14】，大量研究也證明其對細胞特異性分化的促進作用,，有望成為組織再生和修復的優(yōu)異材料,。但其機械性能和成型能力限制了廣泛應用，本篇文章旨在總結(jié)優(yōu)化脫細胞基質(zhì)成型加工能力的技術(shù)手段,，調(diào)研結(jié)果說明,，與單一材料相比，多組分材料的成型加工能力可提升范圍更廣,，且具有可調(diào)諧的機械性能,，是未來dECM生物墨水在3D結(jié)構(gòu)構(gòu)建中的發(fā)展方向。

參考文獻
【1】Choi, Yeong-Jin, et al. Journal of Materials Chemistry B, 2018, 6(35): 5530–39.
【2】Li, Shuyi, et al. Composites Part B: Engineering, 2022,234: 109620
【3】Karakaya, Ece, et al. Macromolecular Bioscience, 2022: 2200303.
【4】Ahn, Geunseon, et al. Scientific Reports, 2017,7(1):8624.
【5】Toprakhisar, Burak, et al. Macromolecular Bioscience, 2018,18(10): 1800024.
【6】Noor, Nadav, et al. Advanced Science, 2019,6(11):1900344.
【7】Chae, Suhun, et al. Bioactive Materials, 2023,19 (1): 611–25.
【8】Jang, Jinah, et al. Acta Biomaterialia, 2016, 33 (3): 88–95.
【9】Parthiban, S Prakash, et al. Biofabrication 2021, 13(3):035031.
【10】Kim, Hyeonji, et al. Advanced Functional Materials 2021, 31(32): 2011252.
【11】Gao, Ge, et al. Applied Physics Reviews 2019,6(4): 041402.
【12】Visscher, Dafydd O, et al. Acta Biomaterialia, 2021, 121: 193–203.
【13】Kim, WonJin, et al. Biomaterials, 2022, 230: 119632.
【14】Traverse, Jay H, et al. JACC: Basic to Translational Science, 2019, 4(6): 659–69.