納米粒子也能治療癌癥,？姜黃素結(jié)合3D腫瘤模型給出肯定答案

來源： EngineeringForLife

與傳統(tǒng)治療方法相比,，納米藥物因其具有更好的靶向性,、更高的給藥效率和良好的水溶性而引起越來越多的關(guān)注。然而,，傳統(tǒng)的藥物療效評估方法是基于單細胞的2D培養(yǎng)方法來獲得體外治療效果,，這可能不能代表實際腫瘤�,；�于上述考慮,，3D細胞培養(yǎng)模型成為更好的選擇，因為它們可以增加體外系統(tǒng)的復(fù)雜性,，并提供比2D培養(yǎng)更接近體內(nèi)原生的仿生微環(huán)境,。

為此，來自大連理工大學(xué)的宋克東研究員將聚合非離子表面活性劑(Pluronic F127)與姜黃素結(jié)合,，制備了水溶性好,、治療腫瘤效果好的姜黃素納米顆粒(CurNPs)（圖1）。以納米粘土,、海藻酸鈉和明膠為基礎(chǔ)制備的雜化支架具有良好的印刷相容性和良好的生物相容性,。之后使用支架結(jié)合的轉(zhuǎn)移性乳腺癌(MDA-MB-231)細胞構(gòu)建3D腫瘤模型，研究了CurNPs對轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療作用（圖1）,。相關(guān)研究成果以“Curcumin nanoparticles combined with 3D printed bionic tumor models for breast cancer treatment”為題于2022年12月8日發(fā)表在《Biofabrication》上,。

圖1 CurNPs聯(lián)合3D打印Gel/Alg/NC支架治療乳腺癌腫瘤示意圖

1. CurNPs的制備及其性能特征
首先，作者以姜黃素(Cur)和Pluronic F-127 (PF127)為原料采用納米沉淀法制備了姜黃素納米顆粒(CurNPs),。通過各種理化表征對CurNPs的性質(zhì)進行了特異性分析,，并通過體外藥物篩選,，研究了CurNPs在二維環(huán)境下對乳腺癌細胞(MDA-MB-231)和正常細胞(L929)的細胞毒性。（圖2）,。

圖2 CurNPs的生物毒性試驗

2. 生物墨水的特征
在二維環(huán)境下的單細胞研究無法模擬體內(nèi)微環(huán)境的固有細胞組成和行為特征,，從而限制了其體外和體內(nèi)效應(yīng)之間的精確對應(yīng)因此，為了更好地模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境,，作者對具有良好生物相容性和流變性能的3D打印Gel/Alg/NC支架進行了研究,。

將海藻酸鹽/明膠前驅(qū)體溶液中加入納米粘土（NC）作為打印支撐材料，在超純水中按5:4:1的質(zhì)量分數(shù)比(Gel:NC:Alg)制備得到的油墨粘性更大（圖4a左）,。流變結(jié)果表明所制備的油墨具有良好的剪切減薄性能和良好的印刷適性,。油墨之間存在較強的相互作用力，這為印刷后的形狀保持奠定了良好的理論基礎(chǔ),。此外,，油墨的觸變性表征了流體粘度對時間的依賴關(guān)系。還測量了剪切應(yīng)力隨剪切速率的變化,，結(jié)果表明，剪切應(yīng)力-剪切速率曲線的面積較大,，說明油墨的觸變性大,，穩(wěn)定性高，不易變形（圖3）,。

圖3 Gel/Alg/NC油墨的流變性能測試

由此打印出的支架結(jié)構(gòu)平整,，具有良好的支撐性能，不易倒塌（圖4a右）,。利用掃描電鏡可以更直觀地觀察到鈣離子交聯(lián)和EDC/NHS/MES二次交聯(lián)后3D打印支架的微觀形貌,。從圖6b可以發(fā)現(xiàn)，交聯(lián)后的支架孔隙明顯,，表面不規(guī)則且粗糙(圖4c),，這為細胞的粘附奠定了基礎(chǔ)。EDS進一步說明了支架的組成成分,，接觸角的降低說明支架的親水性良好更有利于細胞的粘附,。

圖4 三維Gel/Alg/NC支架的物理性能表征

3. CurNPs在三維腫瘤模型/環(huán)境中的細胞毒性試驗及其作用機制
良好的生物相容性是建立腫瘤模型的先決條件。本研究首先采用活/死染色和CCK-8法檢測支架上L929細胞和MDA-MB-231細胞的增殖情況,，為腫瘤模型的構(gòu)建奠定基礎(chǔ),。結(jié)果表明3D打印Gel/Alg/NC雜化支架中L929細胞和MDA-MB-231細胞的增殖活性均較好，兩組間增殖能力無明顯差異,。說明所制備的Gel/Alg/NC雜化支架具有良好的生物相容性,，均能促進成年正常細胞(L929)和乳腺癌細胞(MDA-MB-231)的粘附和增殖(（圖5）。

圖5 三維Gel/Alg/NC復(fù)合支架細胞增殖試驗

此外,，作者還對CurNPs在三維腫瘤模型/環(huán)境中的細胞毒性進行了試驗,。對于用CurNPs處理的腫瘤模型,，如圖6所示，隨著時間的增加,，加入CurNPs后,，綠色熒光逐漸減少，表明活細胞數(shù)量逐漸減少,，而紅色熒光逐漸增加,，表明死亡細胞數(shù)量逐漸增加。在CurNPs處理的2D孔板中培養(yǎng)的細胞在24小時內(nèi)達到了約90%的細胞死亡率,。

圖6 CurNPs在3D Gel/Alg/NC雜化支架上的細胞毒性測試

接下來,，作者通過3D Gel/Alg/NC支架的H&E染色進一步研究了CurNPs對3D培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞的殺傷作用(圖7)。從H&E染色結(jié)果可以看出,，CurNPs處理4天后,，空白對照組的大部分細胞呈球形聚集狀態(tài)。而CurNPs組的細胞數(shù)量較未處理的空白對照組更為稀疏和分散,，且大部分細胞核可見斷裂,，導(dǎo)致染色效果較差。上述結(jié)果表明,，CurNPs能夠抑制3D Gel/Alg/NC支架培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞,，具有良好的細胞毒性（圖7）。

圖7 H&E染色分析CurNPs對3D腫瘤模型MDA-MB-231的影響

接下來,，作者進一步在3D支架上通過免疫熒光檢測MDA-MB-231細胞中凋亡蛋白(Bcl-2和Bax)的表達,，探討CurNPs對腫瘤模型的作用機制。與對照組相比,，三維支架腫瘤模型中MDA-MB-231細胞的Bcl-2熒光(488 nm和594 nm)表達在CurNPs處理4 d后顯著降低(P < 0.001),。定量分析顯示Bcl-2熒光強度明顯低于對照組，表明CurNPs可以抑制Bcl-2的表達（圖8a-b）,。然后分析細胞凋亡促進因子Bax的表達,，CurNPs處理的三維腫瘤模型顯示出明顯的熒光增強，表明CurNPs可以上調(diào)支架內(nèi)MDA-MB231細胞中Bax的表達（圖8c-d）,。上述結(jié)果表明,，CurNPs可以通過改變3D腫瘤模型MDA-MB-231細胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達來促進細胞凋亡。

圖8 CurNPs處理的3D Gel/Alg/NC支架的免疫熒光分析

4. CurNPs和3D打印Gel/Alg/NC支架的生物安全性評價
最后,，作者通過溶血實驗評估了CurNPs和3D Gel/Alg/NC支架的體內(nèi)血液相容性,。結(jié)果表明在CurNPs和3D支架中均沒有溶血現(xiàn)象（圖9a-b）。作者又分別在96孔板中取出100μl溶血樣品,，在570 nm波長下,，每個樣品平行檢測3個，計算溶血率,，結(jié)果如圖9c-d所示,，實驗組溶血率接近0%,，與圖9a-b結(jié)果一致，進一步證明了CurNPs和3D Gel/Alg/NC支架均具有良好的血液相容性和生物安全性,。

圖9 CurNPs與3D Gel/Alg/NC支架的血液相容性研究

綜上,，本文通過簡單的納米沉淀法成功制備了一種納米治療藥物CurNPs，所制備的CurNPs具有良好的生物相容性,、滿足的水溶性,、良好的發(fā)光性、通過EPR效應(yīng)有效的細胞內(nèi)食以及有效的腫瘤治療效果等優(yōu)點,。此外,，通過簡單的合成方法建立了具有良好力學(xué)和流變學(xué)性能的體外支架腫瘤模型，并通過CCK8,、活/死細胞染色,、SEM等方法驗證了該三維支架能夠更好地模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，能夠較好地代表實際腫瘤,，從而更準確地進行體外藥物篩選,。基于上述分析,，本研究為構(gòu)建多功能納米藥物體外藥物篩選多平臺開辟了新途徑,。

文章來源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/aca5b8