通過水相嵌入式生物打印的界面凝聚實現(xiàn)相互連接管狀通道自由形式3D網(wǎng)絡進行原位內(nèi)皮化

來源：EngineeringForLife

再生醫(yī)學,、高通量藥物篩選和器官移植的新興需求加速了組織樣結(jié)構(gòu)物和器官的體外生產(chǎn)的發(fā)展,。其中,，血管網(wǎng)絡對于產(chǎn)生有功能的組織是至關(guān)重要的,，因為它們提供必要的營養(yǎng)物質(zhì),、氧氣,、生長因子,，以及清除廢物。三維生物打印作為一種復制血管化組織空間復雜性的萬能工具,，前景廣闊,。然而，結(jié)構(gòu)復雜,、相互連接的可灌注腔的三維網(wǎng)絡仍然難以實現(xiàn),。使用瞬變油墨的3D擠壓生物打印和基于數(shù)字光處理(DLP)的生物打印都能夠生產(chǎn)相互連接的通道的3D網(wǎng)絡,，這些通道可以用內(nèi)皮細胞進行后期播種。然而,，這兩個過程都涉及多個步驟,，包括模板刪除、重復清理和后期播種,。這些后期處理可能會影響結(jié)構(gòu)精度,，并喪失3D增材制造的固有優(yōu)勢，如快速原型和簡單性,。更重要的是,，這些方法中使用的大多數(shù)模板材料，如Pluronic F-127和碳水化合物玻璃,，要么不適合攜帶細胞，要么對細胞有劇毒,。因此,，這些方法不支持對播種效率和均勻性要求很高的細胞原位播種。

2022年11月30日,，來自深圳大學孔湉湉副教授,、劉洲副研究員及其團隊在《Advanced Materials》雜志發(fā)表題為“In-situ endothelialization of freeform 3D network of interconnected tubular channels via interfacial coacervation by aqueous-in-aqueous embedded bioprinting”的研究論文，提出了通過ATPS嵌入式生物打印通過界面凝聚在相互連接的細胞襯里管狀通道的自由形態(tài)3D血管網(wǎng)絡的體外生產(chǎn),。新制備的ATPS的界面凝聚不僅保持了水-水結(jié)構(gòu),，而且可以作為細胞附著和生長的絲狀支架。

1. 一步法完成任意設計的空心通道互聯(lián)3D網(wǎng)絡和原位細胞播種
為了在原位細胞播種的情況下自由構(gòu)建微通道的血管網(wǎng)絡,，研究者設計了一種在界面處產(chǎn)生凝聚復合物的雙水相體系,，用于細胞附著和生長。墨水相由右旋糖酐(DEX),、聚賴氨酸(PLL)和活細胞組成,，而基質(zhì)相是oxBC納米纖維和聚乙二醇(PEG)的水溶液混合物。為了形成凝聚復合物,，選擇了弱聚陽離子【因為強聚陽離子具有細胞毒性,，如聚乙烯亞胺(PEI)、聚丙烯胺鹽酸鹽(PAH),、聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)和氯殼聚糖(HACC)】,，聚賴氨酸(PLL)作為攜帶細胞的墨水相。同時,，由于具有羧基的oxBC納米纖維可以為所得到的凝聚復合物提供足夠的機械支撐和絲狀形態(tài),，因此被用作聚陰離子。PLL和oxBC都是水解和酶降解的聚電解質(zhì),。因此,，當油墨相被擠出到基體中時,，油墨中的PLL與基體中的oxBC瞬間在水/水界面處形成凝聚絡合物;oxBC的電離羧基和PLL的質(zhì)子化氨基之間的靜電絡合產(chǎn)生了絲狀膜，作為細胞粘附的支架,。為了在基質(zhì)中保持沉積油墨的任意結(jié)構(gòu),，兩種水相都被調(diào)整為剪切減薄和屈服應力液體。當oxBC濃度為0.5 ~ 3 wt%時,，基體的屈服應力約為1 Pa; 而油墨的壓力約為5mpa,。因此，通過將PLL/oxBC的細胞負載ATPS與嵌入式生物打印相結(jié)合,，可以一步完成任意設計的空心通道互聯(lián)3D網(wǎng)絡和原位細胞播種,。（圖1）

圖1 研究重點和工作流程的示意圖

2. oxBC和PLL在水/水界面的復合凝聚是原位形成膜支架和原位細胞播種的關(guān)鍵
PLL分子與oxBC納米纖維絡合形成的膜質(zhì)支架呈絲狀，適合細胞粘附和擴散,。為了優(yōu)化膜質(zhì)支架的理化性能,，進一步研究了膜質(zhì)支架的界面凝聚過程。一旦墨水相被擠壓到基質(zhì)相,，PLL分子和oxBC納米纖維在界面上的相互擴散就由濃度梯度決定,。由于PLL分子的尺寸比oxBC納米纖維小得多，因此PLL分子的擴散主導了復合凝聚過程,。因此,，PLL的初始濃度較高會導致更厚的凝聚復合體層。事實上,，凝聚PLL/oxBC層的平衡厚度隨PLL濃度線性增加,。相反，當oxBC的濃度從0.25 wt%增加到3 wt%時,，聚結(jié)絡合物層變薄,。這可能是由于在界面另一側(cè)有更多的oxBC納米纖維被PLL分子凝聚，形成了網(wǎng)絡更密集的凝聚復合體,。密集的網(wǎng)絡抑制了PLL的后續(xù)擴散,，呈現(xiàn)出較薄的凝聚復合物層。oxBC濃度越高,，對PLL擴散的抑制作用越明顯,。當PLL墨水在oxBC介質(zhì)中轉(zhuǎn)換時，管狀結(jié)構(gòu)立即出現(xiàn),。PLL濃度越高,，oxBC濃度越低，得到的管狀結(jié)構(gòu)越厚,。管狀結(jié)構(gòu)的滲透性主要由oxBC濃度決定,。由于納米纖維的密集網(wǎng)絡，PLL/oxBC凝聚配合物的管狀結(jié)構(gòu)具有101-102 kPa的彈性模量,，與典型的水凝膠相似,，提供了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和適合在水浴中生長的支持結(jié)構(gòu),。膜支架的滲透性測試進一步支持了PLL擴散為主的過程。我們發(fā)現(xiàn),，粒徑大于500kda的分子很難在凝聚凝膠膜上擴散,。因此，再次證實了界面凝聚主要是由PLL擴散驅(qū)動的,，并在PLL分子耗盡時終止,。因此，通過調(diào)節(jié)PLL和oxBC的濃度,，PLL/oxBC凝聚配合物可以形成穩(wěn)健的管狀結(jié)構(gòu),。（圖2）

圖2 ATPS界面凝聚配合物的形成機理及理化性質(zhì)

3. 形成可變尺寸和自由結(jié)構(gòu)相互連接的可灌注微通道的三維網(wǎng)絡
生物打印機可以實現(xiàn)任意的3D結(jié)構(gòu)。為了確保墨水中細胞的活力,，該研究測試了施加壓力和滲透壓對細胞活力的影響,。發(fā)現(xiàn)滲透壓小于30 mOsm·kg-1和施加壓力在100 kPa以內(nèi)對細胞活力的影響可以忽略不計。隨后,，通過改變打印機頭的大小,，應用不同的壓力和平移速度進行擠壓，測量擠壓螺紋的直徑,。例如,，當P = 66.192 kPa (9.6 PSI),， d =100 μm時,，隨著平移速度從1.67 mm·s-1到25 mm·s-1，打印絲的直徑可以從1800 μm無縫變化到200 μm,。因此，可以通過調(diào)節(jié)平移速度和施加壓力來控制擠壓后可灌注微通道的尺寸。因此,，使用細胞負載墨水創(chuàng)建并在水環(huán)境中保存良好的具有相互連接的空心腔的分支網(wǎng)絡,，其中可灌注的微通道分裂成較小尺寸的子微通道，就像是血管分叉,。同樣,，一系列互聯(lián)網(wǎng)絡的可滲透性可以構(gòu)建和保留具有矩形金字塔、長方體,、螺旋和正多面體等空間結(jié)構(gòu)的微通道,。這些中空結(jié)構(gòu)是足夠堅固的處理和替代在其他懸浮浴，如細胞培養(yǎng)基,。為了優(yōu)化細胞活力,，通常在打印后10分鐘將含有細胞的結(jié)構(gòu)從原始的ATPS培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)基中。最后,，該方法可以用任意設計制造堅固的,、細胞負載的,、可灌注的互連管腔的血管樣網(wǎng)絡。（圖3）

圖3 利用PLL/oxBC嵌入式生物打印技術(shù)構(gòu)建可灌注互聯(lián)腔的任意類血管網(wǎng)絡

4. 賦予打印的血管網(wǎng)絡生物功能
為了賦予打印的血管網(wǎng)絡生物功能,，該研究在墨水階段混合內(nèi)皮細胞,，以促進在打印微通道的管腔上進行原位播種。優(yōu)化并固定PLL的濃度為0.05 wt%,， oxBC相的濃度為0.5 wt%,，以同時確保細胞相容性、細胞附著性和印刷適性,。打印結(jié)構(gòu)后,，將其轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)基中進行后續(xù)操作。發(fā)現(xiàn)PLL/oxBC支架上的種子細胞在第1天開始擴散和增殖,，在第3天微通道內(nèi)表面形成均勻的細胞襯里,。PLL/oxBC納米纖維的靜態(tài)附著期和絲狀網(wǎng)絡的結(jié)合，有助于將良好的細胞粘附,、擴散和增殖,。由于墨水階段的細胞不能在界面上擴散，因此它們附著在界面上的凝聚復合體上,。據(jù)報道,，內(nèi)皮細胞與支架的靜態(tài)附著時間對于形成穩(wěn)定的內(nèi)皮單層很重要。使用同樣的方法,，發(fā)現(xiàn)很少有內(nèi)皮細胞可以附著在PLL/藻酸鹽支架上,，它們的形態(tài)保持球形且不增殖。相比之下,，PLL/oxBC支架上的種子細胞在7天內(nèi)增殖175%,，表明oxBC的納米纖維網(wǎng)絡，類似于膠原纖維的納米纖維網(wǎng)絡,，可以招募內(nèi)皮細胞并促進細胞生長,。培養(yǎng)3天后，內(nèi)皮細胞粘附增加,。提示在存在完整的內(nèi)皮單層時,，細胞間接觸良好。平滑肌細胞也有相同表型,。為了評估生成的血管網(wǎng)絡的功能,，研究了其灌注和滲透性特征。結(jié)果表明,，通過結(jié)合細胞負載ATPS墨水和嵌入式生物打印的方法,，內(nèi)皮單層足以模擬血管的屏障功能。因此,，該方法為構(gòu)建內(nèi)皮管腔生物功能復雜網(wǎng)絡提供了一種方便有效的方法,。（圖4）

圖4 人造維管組織結(jié)構(gòu)物的雙重功能

本研究通過在水-水三維嵌入式生物打印中利用界面凝聚策略,，生成了具有自由形態(tài)結(jié)構(gòu)的可灌注互連管腔的內(nèi)皮血管網(wǎng)絡。這種方法允許保留液中液任意結(jié)構(gòu),，也可以作為堅固的絲狀支架,，用于在墨水階段原位播下活細胞。該方法的建立,，為未來創(chuàng)建厚的血管化組織,、構(gòu)建基礎(chǔ)病理和生理研究的模型、以及藥物評估應用方面提供一種新方法,、新思路,。

文章來源:
https://doi.org/10.1002/adma.202209263