《Adv Sci》：軟骨內(nèi)成骨雙重調(diào)節(jié)的三維生物打印各向異性支架重建肱骨頭

來源： EngineeringForLife

組織工程學(xué)在理論上被認(rèn)為是一種很有前途的重建生物關(guān)節(jié)的方法,，因此為晚期骨關(guān)節(jié)炎的治療提供了一種潛在的選擇,。然而,，到目前為止，在大型生物關(guān)節(jié)的再生方面還沒有取得重大進(jìn)展,。

最近,，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院骨科朱俊峰在《Advanced Science》上發(fā)表了題為Regeneration of Humeral Head Using a 3D Bioprinted Anisotropic Scaffold with Dual Modulation of Endochondral Ossification的文章。研究者利用三維打印技術(shù),，設(shè)計并一步制作了一種兔子肱骨頭再生仿生支架,，促進(jìn)了軟骨下骨再生。

研究者首先使用激光獲取了兔近端肱骨關(guān)節(jié)的形態(tài),，并設(shè)計了一種解剖學(xué)上正確的仿生支架,，然后利用多噴嘴3D打印系統(tǒng)，制備了具有不同生化線索和不同結(jié)構(gòu)的滑膜關(guān)節(jié)支架,，如圖1所示,。

圖1 基于CAD/CAM技術(shù)構(gòu)建了不同結(jié)構(gòu)和組成的兔肱骨頭支架

隨后，研究者進(jìn)行了生物相容性研究，培養(yǎng)1,、3,、5、7d后,，BMSCs均勻分布于支架內(nèi)(圖2A),。各組間細(xì)胞存活率都很高(超過95%)，統(tǒng)計分析表明不同組之間沒有顯著差異(圖2B),。此外,，細(xì)胞增殖能力隨培養(yǎng)時間增加而增強(qiáng)。這些結(jié)果表明所制備的生物支架具有良好的生物相容性,，可用于細(xì)胞的長期生長,。

圖2 激光共聚焦掃描檢測支架的生物相容性

研究者結(jié)合不同的生化線索(甲狀旁腺激素[PTH]和化學(xué)成分羥基磷灰石[HA]分別位于內(nèi)外區(qū)域)用于軟骨內(nèi)成骨的雙重調(diào)節(jié)。外區(qū)動態(tài)機(jī)械刺激聯(lián)合生長因子PTH抑制軟骨內(nèi)成骨,，促進(jìn)軟骨再生,；內(nèi)區(qū)動態(tài)機(jī)械刺激聯(lián)合HA促進(jìn)軟骨內(nèi)成骨，促進(jìn)軟骨下骨再生,。

經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測,，動態(tài)加壓和生化刺激組的相關(guān)基因表達(dá)最高(圖3B-D)，且生物力學(xué)刺激的基因促進(jìn)效果要高于生化刺激組,。

結(jié)果表明,，動態(tài)機(jī)械加壓復(fù)合PTH雙刺激支架能更好地誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，抑制軟骨內(nèi)成骨,，而動態(tài)機(jī)械加壓復(fù)合羥基磷灰石(HA)則刺激軟骨內(nèi)成骨過程,，有利于BMSCs的體外成骨。

圖3 模擬柱狀支架上軟骨層和下軟骨下骨層軟骨內(nèi)成骨相關(guān)基因的表達(dá)

為了從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步評價生物3D打印支架對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨內(nèi)成骨過程的調(diào)控作用,，研究者在體外培養(yǎng)30d后對不同支架的外層和內(nèi)層進(jìn)行了Col-II和Col-X的免疫熒光染色,。如圖四所示，雙刺激組顯著高于單刺激組高于無刺激組,，與基因檢測結(jié)果一致,，表明在甲狀旁腺素動態(tài)加壓的協(xié)同作用下，抑制了BMSCs的軟骨內(nèi)成骨和成軟骨能力,，而在生物力學(xué)刺激和HA誘導(dǎo)的聯(lián)合作用下,，顯著促進(jìn)了軟骨內(nèi)成骨的發(fā)展。

圖4 體外刺激后Col-II和Col-X的免疫熒光分析

進(jìn)一步平均不同刺激物對軟骨再生的促進(jìn)作用,，組織學(xué)分析顯示,，非刺激組表面僅見少量散在的軟骨組織。相反,，染色顯示支架表面生成的軟骨組織的厚度和覆蓋率逐漸增加(圖5),。

在生化,、生物力學(xué)和雙重刺激組中。雙刺激組表層再生較厚,、連續(xù)的軟骨,，有較好的ECM沉積，SO/FG染色顯示軟骨基質(zhì)增多,，HE和Masson染色顯示細(xì)胞填充良好,。相比之下，生化組和生物力學(xué)刺激組的軟骨較薄,。

圖5 各組體外刺激后肱骨頭硬組織切片的組織學(xué)觀察

接下來研究者對肩關(guān)節(jié)進(jìn)行X光和MRI掃描,，以評估植入的肱骨頭修復(fù)的固定和再生組織的形成(圖6)。從新生骨密度,、再生肱骨形狀、是否脫位等方面,，雙刺激組最好,，單刺激組次之，均優(yōu)于無刺激組,。

圖6 植入支架后4個月拍攝肩關(guān)節(jié)X線片和MRI照片

最后研究者對體內(nèi)再生肱骨頭的炎癥,、組織學(xué)和力學(xué)評價，得到了雙刺激組炎癥下降最明顯的結(jié)論,。并在4個月后對動物實施安樂死,，并收集標(biāo)本進(jìn)行大體觀察。結(jié)果顯示,，在無刺激組中,，殘留的肱骨頭支架中新形成的組織大部分為纖維化組織，幾乎沒有軟骨和骨再生,。且從視覺組織學(xué)評估量表,、機(jī)制密度、軟骨體積等方面,，雙刺激組結(jié)果均最好(圖7),。

再軟骨下區(qū)域，再生骨量在雙刺激組中最高,，其次是生物力學(xué)組,、生化組（圖 8A）,并且沒有刺激組。骨體積/總體積比(BV/TV),、骨表面/骨體積比(BS/BV)和成骨細(xì)胞數(shù)量的定量分析進(jìn)一步驗證了這一趨勢（圖8B-D）,。

這些結(jié)果表明，生物力學(xué)刺激促進(jìn)了再生軟骨組織的軟骨內(nèi)骨化過程,，加速了成熟骨組織的形成,。

圖7 體內(nèi)半肩關(guān)節(jié)置換術(shù)后肱骨頭軟骨再生的組織學(xué)檢查

圖8 體內(nèi)半肩關(guān)節(jié)置換后肱骨頭軟骨下骨再生的組織學(xué)檢查

綜上,，研究者展示了一種3D生物打印支架，具有各向異性結(jié)構(gòu)和類似于天然肱骨頭的異質(zhì)成分,。通過動態(tài)壓縮和調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)骨化的生化線索的雙重刺激,，實現(xiàn)了透明軟骨和軟骨下骨的各向異性再生。這種方法還為設(shè)計和制造具有臨床相關(guān)尺寸的解剖學(xué)上匹配的大型植入物提供了替代方案,。

文章來源：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202205059