生物3D打印神經樣纖維可以改善生態(tài)微環(huán)境從而促進大段脊髓損傷再生

來源： 上普生物

生物3D打印在以自下而上的裝配方式制造仿生活性結構體方面具有巨大的前景,。近日,，一篇名為“3D bio-printed living nerve-like fibers refine the ecological niche for long-distance spinal cord injury regeneration”的文章由清華大學的王秀梅教授研究團隊在Bioactive Materials (IF=16.87)上發(fā)表,。該文章通過基于擠壓式生物3D打印技術制備了活體神經樣纖維用于脊髓損傷治療,�,；铙w神經樣纖維由神經干細胞(NSCs)組成，大量神經干細胞被包裹在一種模擬細胞外間質(ECM)的水凝膠內,，組裝成一種高度空間有序的結構，形似于密集排列的神經纖維束,。通過4mm大段完全橫斷脊髓損傷大鼠模型測試了活體神經樣纖維的促神經發(fā)生能力,。研究顯示，活體神經樣纖維通過免疫調節(jié),、血管生成,、神經發(fā)生、神經中繼形成和神經回路重塑來改善缺陷部位的生態(tài)微環(huán)境,，完成了出色的功能重建,，揭示了植入后活性結構的演變過程，為脊髓損傷的臨床治療提供了新思路,。

背景介紹
脊髓損傷是一極為嚴重的中樞神經系統(tǒng)破壞,，可能導致永久性運動和感覺功能障礙，給患者帶來巨大的身體和心理痛苦還有沉重的經濟負擔,。為了恢復脊髓損傷后被破壞的神經功能,，臨床上使用了包括手術，藥物,，細胞治療,，生物材料植入和物理刺激在內的巨大努力致力于重建神經回路和損傷后的神經元通信，但效果仍然遠遠不能令人滿意,。治療效果有限的主要原因是損傷部位的不利于生態(tài)微環(huán)境逐漸形成,，伴隨著內源性促進劑不足,，神經元丟失，軸突惡化和脫髓鞘,，缺血,，神經炎癥和膠質瘢痕形成等一系列病理事件。因此,，如何改善整個損傷部位的生態(tài)微環(huán)境已被視為脊髓損傷治療的關鍵戰(zhàn)略目標,。

在過去的二十年中，神經干細胞(NSCs)移植已經成為一個令人鼓舞的脊髓損傷治療方案,，因為神經原性和神經保護的雙重功能,。人們普遍認為，植入的具有自主分化能力的NSCs可以補充受損的細胞,，并分泌大量的神經營養(yǎng)因子作為活的“生物工廠”來滋養(yǎng)微環(huán)境,，產生新生的神經回路和進一步修復功能。此外,，植入的神經干細胞可以誘導內源性神經干細胞遷移到病變部位以促進脊髓再生,。盡管神經干細胞移植是一種有效的修復策略，但它通常面臨不利于生存的炎癥微環(huán)境,，導致留存率低,，細胞存活率低，遷移分化不受控制等安全性問題,，大大減少了治療效果,。值得注意的是，體內神經干細胞位于一個特定的三維(3D)微環(huán)境,，其中包括與相鄰細胞,、可溶性因子和細胞外間質(ECM)的高度活躍的相互作用，為NSC粘附提供結構支持,，并為調節(jié)細胞功能和基質沉積的信號轉導提供平臺,。脊髓損傷后，典型的 ECM 結構和功能受到嚴重破壞,。因此,，生物材料支架作為一種人工細胞外基質是必不可少的，以重建有利微環(huán)境和調節(jié)細胞群組織再生,。以生物材料為基礎的干細胞移植作為一種有希望的脊髓損傷治療方法已經受到廣泛關注,，該方法有助于在移植后調節(jié)干細胞功能，并避免細胞治療的缺點,。

圖1. 生物3D打印活體神經樣纖維和新生功能網(wǎng)絡體內重塑的示意圖,。

實驗過程與結果
生物墨水的選取與表征
考慮到中樞神經系統(tǒng)的天然 ECM 成分，該文章設計了一種明膠和透明質酸組成的混合水凝膠,，以創(chuàng)建特定的生態(tài)微環(huán)境,。將明膠和透明質酸分子骨架與甲基丙烯�,；�進行化學功能化，合成了接枝度分別為60%和18%的 GelMA和HAMA,。該材料可以通過光聚合后的碳-碳雙鍵(1640cm-1)共價共軛在一起,，形成一個混合網(wǎng)絡。GelMA(5%w/v)和 HAMA(1%w/v)的復合材料在25-28°C 附近表現(xiàn)出明顯的熱響應行為與粘度的急劇下降,，證明其溶膠-凝膠轉變在28°C,，同時，材料體系在28°C 時表現(xiàn)出典型的剪切變稀行為,，這對于保護打印過程中的細胞免受剪切力損傷是必要的,。此外，GelMA/HAMA 溶液在紫外線(UV)照射下可發(fā)生快速凝膠化過程,。因此,，生物墨水具有良好的可打印性，結合溫敏交聯(lián)和光交聯(lián),，可以很容易地制造各種高精度結構體,。

圖2. 支架的制造與表征。A-C)各種3D 打印結構,。D)3D 打印網(wǎng)格,。

E-F)3D 打印支架的掃描電鏡圖像。G-H)用平行線性陣列組裝的支架,。

載神經干細胞生物墨水的生物3D打印和表征
從胚胎 SD大鼠的海馬體中分離出神經干細胞,，并用巢蛋白抗體進行鑒定。為了評估3D 生物打印后 GelMA/HAMA 中NSC的細胞活性和功能,，制備高細胞密度(107/mL)的 NSC 載體生物墨水，并在進行生物3D打印以形成活性結構體,，轉移到培養(yǎng)基中并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。通過 Live/Dead 染色測定在體外評估構建體內 NSCs 的活力，其在打印后結構體極高的活性(94.69%±2.35%) ,，并且在7天后仍然可以維持高活性水平,。為了追蹤包裹在活體結構體中的神經干細胞的形態(tài)，研究在3天的細胞培養(yǎng)后進行了細胞骨架染色,。結果表明,，GelMA/HAMA 水凝膠能明顯拉長絲狀偽足，為神經干細胞的粘附和擴散提供了合適的生態(tài)微環(huán)境,。此外,，用 RT-PCR 監(jiān)測神經干細胞的分化行為。神經干細胞的干細胞特異性基因巢蛋白和 SRY-box 轉錄因子2(Sox2)在含有增殖培養(yǎng)基的3D水凝膠中的表達遠高于其他組的神經干細胞,，表明3D水凝膠可以在無血清環(huán)境中維持神經干細胞的自我更新和多能性,。相比于不含生長因子的平面培養(yǎng),，水凝膠中的神經干細胞表達了更高的神經元特異性基因 βIII 微管蛋白(Tuj-1)，和更低的膠質纖維酸性蛋白(GFAP)表達,。同時進行免疫熒光染色以觀察神經干細胞在三維水凝膠內的分化行為(圖3 d-f) ,。更多的 Tuj-1陽性神經元和相對較少的 GFAP 陽性星形膠質細胞在水凝膠內產生，三維環(huán)境賦予了被包裹的神經干細胞狀態(tài)依賴性的細胞行為,，以調節(jié)干細胞維持和神經元分化的協(xié)調性,。此外，細胞內的鈣信號在細胞功能和各種神經元的信號轉導方面起著關鍵作用,。為了確定從神經干細胞分化出來的神經元是否在3D 結構中起作用,，研究在培養(yǎng)2周后進行了 Fou-4鈣成像測試。將細胞與Fou-4 染料孵育后,，用共聚焦顯微鏡監(jiān)測熒光強度,，并記錄其對谷氨酸神經遞質的反應。在添加谷氨酸67秒后捕獲鈣瞬變,，這表明神經元功能活躍,，能夠通過自發(fā)活動傳遞信號。作為一種活性結構體,，神經干細胞3D 水凝膠有望為其他神經元的粘附和生長提供一個合適的生態(tài)微環(huán)境,，這可能會顯著影響宿主和移植物之間的整合。

圖3. 載有神經干細胞的生物3D打印體及表征,。A)培養(yǎng)0天的生物3D打印載 NSCs 水凝膠的活(綠色)/死(紅色)染色圖像,。B)在第0天(2小時) ，第1天,，第3天和第7天培養(yǎng)的生物3D打印的 NSC 載體水凝膠中的細胞活性(%),。C)培養(yǎng)3天的載有 NSC 的生物3D打印水凝膠中的細胞骨架染色圖像。D)培養(yǎng)7天染色的 DAPI (藍色) ,，Tuj-1(綠色)和 GFAP (紅色)的生物3D打印的含NSCs水凝膠圖像,。E-f)(d)中白色框選區(qū)的放大圖像。G)培養(yǎng)14天的生物3D打印 NSC水凝膠內神經元的鈣成像,。相對神經活動顯示為顏色編碼,，信號強度范圍從黑色(非活躍)到白色(高活躍)。加入谷氨酸后測量和記錄H)陽性細胞的熒光強度隨時間變化,。

體內免疫微環(huán)境的調節(jié)
將大鼠隨機分為3組,，將不含細胞3D水凝膠(支架組，S組)或載NSC-3D生物支架(載NSC支架組,，SN組)植入病變部位填充空腔,，以不植入任何內固定物的未處理脊髓損傷組作為對照組(SCI組)。脊髓損傷可能引起一系列炎癥事件，并在損傷后7天達到高峰,。在這種情況下,，炎癥微環(huán)境對于移植的神經干細胞在體內的存活及其長期的神經修復作用具有至關重要的意義。小膠質細胞/巨噬細胞是脊髓損傷后炎癥過程中的關鍵調節(jié)細胞,。因此,，研究進行了 CD68免疫熒光染色來表征總巨噬細胞/小膠質細胞的活化，并與 CD206共標記,，以定位 M2極化的巨噬細胞/小膠質細胞,。巨噬細胞表型從促炎 M1向抗炎 M2的轉變在指導組織修復中尤為重要。然而,，這種轉變在脊髓損傷中通常是停滯不前的,。在該研究中，研究發(fā)現(xiàn) S 組相比于比SCI組而言活性巨噬細胞數(shù)量顯著減少,，M2巨噬細胞比例顯著增加,，表明植入 ECM 樣支架有利于炎癥調節(jié)功能。這些結果可以通過植入的支架的機械性能,，具有適當孔隙率和仿生ECM組分可調節(jié)巨噬細胞的浸潤和極化來解釋,。與 S 組相比，SN 組活化的巨噬細胞數(shù)量顯著減少,，M2巨噬細胞百分比顯著提高,，表明活神經樣纖維內的 NSCs 也顯示出顯著的抗炎功能，這可能是由炎性細胞因子和 NSCs 分泌的細胞因子之間的復雜相互作用引起,。此外,，先前的研究表明，核酸藥物重編程的雪旺細胞可以通過增強的細胞間通訊促進巨噬細胞進入 M2表型,，這證明了細胞間通信（cell-cell crosstalk）在調節(jié)免疫信號傳導中的重要性,。ECM 樣水凝膠和負載的 NSCs 協(xié)同作用，導致?lián)p傷后免疫微環(huán)境中細胞-細胞通訊和細胞-生物材料相互作用的增強,，這可以有效地指導募集的巨噬細胞進入 M2表型并減輕局部炎癥反應,。總的來說,，活體神經樣纖維通過水凝膠和 NSCs 對炎癥微環(huán)境的協(xié)同反應呈現(xiàn)出突出的免疫調節(jié)功能，有助于加速從促炎癥到抗炎的炎癥狀態(tài),，并將受損組織推向修復和再生,。星形膠質細胞現(xiàn)在被認為是脊髓損傷后重塑的參與者，它可以被激活并對炎癥環(huán)境作出反應,。為了研究活體神經樣纖維在急性炎癥階段如何調節(jié)星形膠質細胞,，研究分別用膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和 Iba-1標記星形膠質細胞和小膠質細胞/巨噬細胞。值得注意的是，在 SCI 組中,，大量活化的星形膠質細胞已經遷移到病變部位并形成致密的壁狀構造,，并且創(chuàng)建了隔離相鄰宿主脊髓和病變核心的柵欄樣邊界。這種由強烈激活的星形膠質細胞形成的壁狀結構可能構成軸突生長的物理和化學屏障,。相反,，在 S 和 SN 組中，在病變邊緣發(fā)現(xiàn)松散排列的星形膠質細胞以橋式模式連接宿主脊髓和植入物,，表明星形膠質細胞由于抑制巨噬細胞活化處于幼稚狀態(tài)而不是瘢痕形成狀態(tài),。此外，這種橋狀星形膠質細胞可以作為一個支持的備用軸突,，有助于神經網(wǎng)絡重建,。

圖4. 活體神經樣纖維調節(jié)炎癥反應。A-B)損傷后1周,，三組受傷脊髓的前段,、病變段和尾段的CD68(綠色)、 CD206(紅色)和 DAPI (藍色)免疫熒光染色圖像,。C-D)定量檢測 CD68陽性細胞密度,、 M2巨噬細胞極化率。E)三組損傷部位的 DAPI (藍色) ,，GFAP (白色) ,，Iba1(紅色)的免疫組織化學染色的圖像。虛線標記了病變部位和宿主脊髓之間的邊界,。黃色五角星表示損傷部位,。

重建新生神經元的生態(tài)微環(huán)境
由反應性膠質瘢痕分泌的硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPGs)已被證明是軸突重塑的主要抑制劑，導致脊髓損傷后神經再生失敗,。研究進一步分析了CSPG對不同組中軸突生長錐的抑制作用,，在損傷后12周，通過染色 CS-56來標記CSPG,，并染色GAP43來標記軸突生長錐,。在脊髓損傷組，大量CSPG沉積在損傷部位形成密集的化學屏障,，阻礙宿主神經跨界生長進入損傷部位,。此外，放大的圖像表明,，再生軸突停止在 CSPG 豐富的區(qū)域,。這是因為軸突生長錐對微環(huán)境的特征高度敏感。一旦他們到達病變核心含有豐富的CSPG,，他們停止生長和由于營養(yǎng)不良收縮成球,。由于ECM樣水凝膠的免疫調節(jié)作用，S組CS-56陽性面積明顯減少，并且在損傷邊界上觀察到一些出芽的軸突,。值得注意的是,，SN組中CS-56陽性區(qū)域很少，而是以相對對齊的模式被高密度的 GAP43陽性軸突取代,，這表明在病變部位正在進行較好的神經軸突再生,。

由于新生神經元經歷增殖，軸突延伸和神經網(wǎng)絡形成,，需要同步血管化來滿足神經組織再生過程中營養(yǎng)物質和代謝交換的需求,。因此，為損傷部位創(chuàng)造一個再生的神經血管生態(tài)微環(huán)境對于新生神經元功能化和組織再生至關重要,。為了進一步了解活體神經樣纖維的協(xié)同再生作用,，通過在損傷后12周對 Tuj-1和大鼠內皮細胞抗原-1(RECA-1)進行免疫染色來觀察新生神經元和血管。在 S 組和 SN 組的病變部位可以觀察到更均勻分布的 RECA-1和 Tuj-1陽性細胞,，表明新生神經元受到營養(yǎng)結構的支持,。值得注意的是，SN 組的共焦 z 疊加圖像顯示有一些新生血管具有管腔樣結構,，在病變部位的新生神經元周圍均勻再生,，這為新生神經元向功能化方向發(fā)展奠定了基礎。結果表明,，活體神經樣纖維通過減少抑制性化學屏障的產生和重建血管系統(tǒng),，優(yōu)化了新生神經元的生態(tài)位，有助于維持其可持續(xù)的功能,。

圖5. 活體神經樣纖維為新生神經元創(chuàng)造了一個合適的生態(tài)微環(huán)境,。A)在傷后12周，在三組中代表性的低和高放大率免疫熒光圖像的 DAPI (藍色) ,，GAP43(紅色)和 CS-56(綠色),。B)損傷后12周，三組受損脊髓的前段,、病變段和尾段的DAPI (藍色) ,，Tuj-1(紅色)和 RECA-1(綠色) 代表性免疫熒光圖像，黃色五角星表示損傷部位,。虛線標記了病變部位和宿主脊髓之間的邊界,。C-d) SN 組病變部位的高倍 Z- 疊加圖像; 箭頭，具有管腔樣的血管結構,。

神經再生和髓鞘再生
對于打算脊髓損傷修復,，損傷核心神經元的補充是神經回路重建的基礎。為了鑒定和評估不同處理的完整橫斷脊髓的神經元再生能力,，研究對神經元 III 類 β-微管蛋白(Tuj-1)進行免疫染色以顯現(xiàn)新生神經元，生長相關蛋白-43(GAP43)以顯現(xiàn)再生出芽軸突和神經絲200(NF)以檢測成熟的神經纖維。SN組損傷部位有豐富的再生 Tuj-1陽性細胞,，與 S組(P<0.01)和SCI組(P<0.001)相比顯著增加,。同時，S組由于ECM 樣水凝膠的免疫調節(jié)作用,，減少了瘢痕組織的形成,，從而使多余的神經元遷移到損傷部位。而活體神經樣纖維不僅為存活體神經元建立了良好的生態(tài)位,，而且從原位神經干細胞的神經發(fā)生中補充了大量的神經元,。軸突的生長方向是高度敏感的，并且通過整合外部線索使其終端樹枝狀朝向正確的目標,。 SCI和S組相比,，SN組中的GAP43陽性軸突以相對均勻和定向的模式排列，這可能是由于在印刷纖維中均勻分布的 NSCs 的高密度可以作為指導神經元通過直接接觸或旁分泌手段延伸的方向,。GAP43陽性軸突的定量分析表明,，與SCI(P<0.001)和S組(P<0.001)相比，SN組具有最高的出芽軸突密度,，這表明3D 打印的活神經樣纖維提供的再生軸突的理想生態(tài)位(圖6b8),。最重要的是，與SCI和S組相比,，豐富的神經纖維不僅在病變邊緣而且在病變核心處再生,，并且在 SN組中連續(xù)分布(圖6a9) ，表明活體神經樣纖維的均勻,，快速和強大的神經再生能力,。這些結果表明，ECM樣水凝膠和充足的神經干細胞組裝的活體神經樣纖維3D 為更好的神經再生提供了一個優(yōu)越的平臺,。

圖6.活體神經樣纖維增強神經再生,。A1-A3)損傷后12周，三組脊髓縱向切片的代表性免疫熒光圖像,，DAPI (藍色)與 Tuj-1(紅色)共同染色,。B1-B3)分別來自 A1、 A2,、 A3的放大圖像,。A4-a6)損傷后12周，三組脊髓縱向切片的代表性免疫熒光圖像,，DAPI (藍色)與 GAP43(紅色)共同染色,。B5-B7)放大圖像分別來自 A4，A5,，A6,，傷后12周,。A7-A9)損傷后12周，三組脊髓縱向切片的代表性免疫熒光圖像,，DAPI (藍色)與 NF (紅色)共同染色,。B9-A11)分別來自 A7、 A8和 A9的放大圖像,。B4) Tuj1陽性軸突密度的定量分析,，B8) GAP43陽性軸突密度和 B12) NF 陽性軸突密度(陽性免疫反應面積/總面積) ; n=5。

髓鞘包裹軸突,，使軸突電絕緣,，提高神經傳導的速度和準確性，同時為軸突提供營養(yǎng)支持和保護,，所以髓鞘再生在重建神經元信號轉導系統(tǒng)中起關鍵作用,。在損傷后12周，通過甲苯胺藍染色和透射電子顯微鏡(TEM)分別檢查所有組中神經損傷部位的半薄和超薄切片,。在SN組中,，大部分再生神經纖維被髓鞘包裹。相比之下,，S組的神經纖維顯示出大量的再生軸突,，而髓鞘小而薄。此外,，在脊髓損傷組,，很少有再生軸突和髓鞘。定量分析顯示,，SN組有髓神經纖維密度(20225±2747神經/mm2)顯著高于 S組(9092±3228神經/mm2,，P <0.001)和 SCI組(2918±656神經/mm2，P<0.001)(圖7c),。為了進一步評估再髓鞘形成的程度,，使用 TEM 通過超微結構分析計算基于面積的 G 比率(軸突面積/整個有髓軸突面積) ，并通過箱形圖(圖7d)和散點圖(圖7e)呈現(xiàn),。SN 組面積比(0.42±0.06)顯著低于S組(0.53±0.04,，P<0.001)和 SCI組(0.61±0.44，P<0.001) ,，表明髓鞘再生相對成熟,。此外，與 S組和 SCI組相比,，SN 組的再生神經纖維顯示更大的有髓神經纖維,，反映了活神經纖維的持續(xù)促髓鞘形成能力。然后,，研究分別使用髓鞘基礎蛋白(MBP,，表示髓鞘)和 NF (表示神經纖維)在病變部位通過 IF染色縱向和橫向切片觀察軸突的髓鞘形成,。在 SN 組中，縱切片的Z疊加共定位圖像顯示再生的神經纖維包裹著密集和有組織的髓磷脂,，并且 z切片顯示由髓磷脂環(huán)繞神經纖維組成的典型的“殼核”結構,。相比之下，這種結構在 S 組中不太普遍,，在 SCI 組中偶爾出現(xiàn)。這些結果提示支架移植能促進軸突再生,，但再生軸突不足,，髓鞘重建不足。同時,，活體神經樣纖維移植到損傷部位可顯著促進軸突再生和髓鞘再生,。

圖7.活體神經樣纖維促進髓鞘再生。A-B)分別在 SCI,，S 和 SN 組的病變部位的橫切片的甲苯胺藍染色和 TEM 圖像,。C)來自甲苯胺藍染色圖像(數(shù)量/總面積)的有髓神經纖維密度的定量分析。D)透射電鏡圖像中基于面積的 G 比值的定量分析,。E)來自 TEM 圖像的G比與神經纖維面積的散點圖; F) SN 組脊髓縱向和橫向切片的代表性免疫熒光圖像,，共同染色 NF (綠色)和 MBP (紅色)。G) SN組縱向切片病變部位的高倍 Z- 疊加圖像,。

神經中繼形成和功能性神經網(wǎng)絡重構
外源性 NSCs 衍生的神經元可以通過形成突觸連接作為宿主脊髓和病變部位之間的“信號中繼站”,，這被認為是嚴重 SCI 修復的有希望和有效的策略。損傷后12周,，研究用 NF 和 SYN (突觸前標記物突觸素 I)標記受損脊髓的縱向冷凍切片,，從而可視化再生神經纖維之間的突觸形成。此外,，在SN組中,，GFP被用來區(qū)分移植細胞和宿主細胞。IF染色結果顯示,，移植到損傷部位的活體神經樣纖維在整個損傷部位實現(xiàn)了廣泛和強大的神經纖維再生,。同時，在SN組病變核心有許多有序的 GFP/NF 共陽性(指移植來源的神經元)和一些 NF 陽性神經纖維(指宿主神經元),。這些纖維密切接觸,，并已檢測到高密度SYN信號，表明新生突觸來源于移植物和宿主神經元,。透射電鏡顯示SN組再生突觸的超微結構,。此外，新生軸突中形成的再生突觸百分比的定量分析顯示 N (3.40±1.36%)和SN(10.79±3.62%)組之間有顯著差異(P<0.001),， SN組中的再生神經元具有改善的連接性,�,？偟膩碚f，這些結果表明,，活體神經樣纖維可以在病變部位建立外源性神經元中繼,，并與宿主神經元整合，有助于傳遞來自脊髓上下行通路的信號,。

為了探索新生神經元網(wǎng)絡的功能,，研究通過染色膽堿乙酰轉移酶(chAT) ，酪氨酸羥化酶(TH)和血清素(5-HT)分別鑒定了膽堿能,，多巴胺能和5-羥色胺能軸突的再生,。在SN組，結果顯示在病變部位有大量可見的NF和ChAT雙染色的軸突,，并且大部分共表達GFP,。同樣，病變部位連續(xù)和豐富的 NF 陽性軸突顯示TH和GFP陽性信號,。此外,，Z疊層圖像顯示，與移植物分化的5-HT陽性軸突在病變核心表現(xiàn)出大約260μm 的延伸,。相比之下,，其他組在損傷部位很少觀察到功能性神經元的染色。上述結果表明,，活體神經樣纖維內的神經干細胞可分化為與運動和感覺有關的功能性神經元,。此外，在 SN組的病變部位也觀察到一些非 GFP表達的功能性神經元(即宿主細胞) ,，這可能是由于移植的活神經樣纖維提供的微環(huán)境改善,，導致一些內源性功能性神經元的募集。

圖8. 這些活體神經樣纖維重塑了一個功能性的神經網(wǎng)絡,。A) SN 組脊髓縱向切片的代表性免疫熒光圖像與 GFP (綠色) ,，NF (紅色) ，SYN (白色)共染色; A2-A5)來自(A1)的放大圖像; A6)染色 GFP (綠色) ,，NF (紅色) ,，SN 組的 SYN (白色)。B) TEM 圖像檢測 SN 組的突觸形成; 黃色箭頭表示經典的突觸結構; 黃色虛線矩形標記插入,，顯示突觸結構的放大圖像,。C) NF 陽性細胞內突觸形成比率的定量分析。n = 5.D1-d3)在 SN 組病變部位的 DAPI (藍色) ,，GFP (綠色) ,，NF (紅色)和 ChAT (白色)免疫標記的代表性圖像。D4-D6)在 SN 組病變部位的 DAPI (藍色) ,，GFP (綠色) ,，NF (紅色)和 TH (白色)免疫標記的代表性圖像,，D7)在 SN 組病變部位的 DAPI (藍色) ，GFP (綠色) ,，NF (紅色)和5-HT (白色)免疫標記的代表性圖像,。E) SN 組 BDA 免疫染色矢狀切片概述。E2-E4)分別在(E1)中放大了前段,、病變段和尾段的圖像,。虛線標記了病變部位和宿主脊髓之間的邊界。

功能恢復和安全評估
在 SCI 后,，研究每周使用 Basso,，Beattie 和 Bresnahan (BBB)評分來評估不同組大鼠的運動恢復情況(圖9a)。與對照組(N組和SCI組)相比,，SN組大鼠表現(xiàn)出統(tǒng)計學上顯著的進行性運動恢復。此外,，對于 SN組,，手術后(0周)大鼠已經從完全癱瘓恢復，平均在傷后12周時偶爾承重背部踏步(中位BBB評分=9),。研究使用Catwalk 分析(圖9b)和傾斜網(wǎng)格試驗進一步評估了傷后12周自主和協(xié)調的運動功能恢復,。SCI組大鼠的足跡顯示出線狀模式，表明后肢持續(xù)拖動(圖9b) ,，與網(wǎng)格測試結果一致,，共同表現(xiàn)出運動功能的負恢復。然而,，S組大鼠可以間歇性地將后肢抬離地面(圖9b) ,，并且在網(wǎng)格上爬行時呈現(xiàn)后肢適度的自主運動，而很少承重,。值得注意的是,，相比之下，SN組大鼠在 Catwalk 分析中表現(xiàn)出更明顯的間歇性足跡(圖9b) ,，同時在爬坡過程中出現(xiàn)頻繁的足底踏步和偶爾的前肢-后肢協(xié)調(圖9c,，視頻 S3)。此外,，在三個不同組的大鼠中進行經顱電生理測試以激發(fā)MEP,，MEP是運動信號傳導能力的可靠指標(圖9d)。結果顯示,，按照SCI,，S和 SN組大鼠的順序，MEP幅度顯著增加,，而 MEP 潛伏期縮短(圖9e-f) ,，表明在 SN 組中,，損傷部位的再生神經中繼有效地促進了電信號的傳導�,？偟膩碚f,，這些結果提供了活體神經樣纖維移植能夠使脊髓損傷后運動功能恢復的證據(jù)。

泌尿系統(tǒng)功能障礙是 SCI 常見但嚴重的并發(fā)癥,，并導致危及生命的后果,。為了進一步研究不同治療方法脊髓損傷后泌尿系統(tǒng)的變化，研究檢查了大鼠膀胱和腎臟的病理學特征三組,，傷后12周,。結果表明，活體神經樣纖維移植可以防止脊髓損傷大鼠膀胱粘膜水腫和肌束紊亂的病理損傷,，這是由于其不僅在局部脊髓而且在全身具有顯著的抗炎作用,。腎組織的研究反映了類似的結果。這些研究結果表明,，脊髓損傷大鼠活神經樣纖維治療,，同時促進神經再生，也保護大鼠免受嚴重的泌尿系統(tǒng)并發(fā)癥,。

圖9.活體神經樣纖維促進功能恢復,。A)運動-傷后每周后肢 BBB 評分。雙向重復測量方差分析(方差分析),。* P < 0.05,，* * P < 0.01，* * * P < 0.001; n = 8.B)貓步系統(tǒng)記錄的有代表性的足跡,。C)大鼠從底部向上爬時后肢的時間序列圖像; 向上箭頭表示時間序列的方向,。D)代表性記錄的皮層運動誘發(fā)電位(MEP)。E-f) MEP 幅度和潛伏期的定量分析; * P < 0.05,，* * P < 0.01,，* * * P < 0.001; n = 3。G)膀胱組織的H&E染色和 Mason 染色圖像,。

結論和展望
總的來說,，生物3D打印的活體神經樣纖維最大限度地發(fā)揮了神經干細胞在脊髓損傷修復中的治療潛力。研究的研究結果提供證據(jù)表明,，ECM樣水凝膠保護外源性神經干細胞免受嚴酷的炎癥環(huán)境,，并為神經干細胞的長期存活，神經譜系分化和功能性突觸形成提供了有利的生態(tài)微環(huán)境,。此外,，類 ECM水凝膠能夠通過支持和粘附作用原位定位外源性神經干細胞，同時通過損傷部位的結構線索引導內源性神經元遷移。通過這種方式,，宿主脊髓識別,，接納并整合外源性 NSCs衍生的再生神經回路，這表明3D打印的活體構建體可以在體內成熟為真正的活組織,，實現(xiàn)了丟失組織的替換,。由于三維生物打印活體神經樣纖維的仿生結構和組成部分，ECM樣水凝膠與攜帶的外源性神經干細胞協(xié)同作用,，發(fā)揮出突出的生態(tài)微環(huán)境重建功能,，協(xié)調有效的免疫調節(jié)、神經發(fā)生,、血管形成,、髓鞘再生、神經中繼形成和神經回路重塑,，共同促進了大段脊髓損傷修復和運動功能恢復,。

參考文獻
Yang J, Yang K, Man W, et al. 3D bio-printed living nerve-like fibers refine the ecological niche for long-distance spinal cord injury regeneration[J]. Bioactive Materials, 2023, 25: 160-175.

https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2023.01.023.