《Biofabrication》：源于GelMA墨水,，打印腫瘤類器官

來源： EngineeringForLife

3D體外腫瘤模型對癌癥生物學(xué)特征研究和藥物開發(fā)至關(guān)重要。但是目前模擬腫瘤微環(huán)境仍然具有難度,，因為腫瘤微環(huán)境是由各種細(xì)胞成分和生物因素組成的異質(zhì)性混合物,。用于腫瘤組織工程的水凝膠材料缺乏相關(guān)物理性相互作用，無法將細(xì)胞釋放的生物活性因子保持在水凝膠內(nèi)并改善旁分泌的相互作用,。近日,，來自美國寺崎生物醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究所Bingbing Li、Hanjun Kim,、Ali Khademhosseini教授團隊進行了用于3D生物打印類器官腫瘤模型的甲基丙烯�,；�明膠和皂石生物墨水的相關(guān)研究。研究成果以“Gelatin methacryloyl and laponite bioink for 3D bioprinted organotypic tumor modeling”為題于6月22日發(fā)表在《Biofabrication》上,。


本文從以下6方面進行系統(tǒng)表征：

1. GelMA/Laponite復(fù)合水凝膠可打印性評估

2. 非交聯(lián)GelMA/Laponite復(fù)合水凝膠可注射性和流變學(xué)評估

3. 載有細(xì)胞的GelMA/Laponite復(fù)合生物墨水體外生物相容性評估

4. 載有細(xì)胞的GelMA/Laponite復(fù)合生物墨水體外細(xì)胞形態(tài)學(xué)評估

5. 使用GelMA/Laponite復(fù)合生物墨水進行高通量制造三維生物打印的胰腺癌類腫瘤模型

6. 三維生物打印胰腺癌類腫瘤模型基因和蛋白質(zhì)表達(dá)分析

圖1 實驗流程示意圖

本研究開發(fā)了一種納米工程離子共價交聯(lián)的生物墨水,，構(gòu)建3D生物打印類器官腫瘤模型。該生物墨水創(chuàng)造了一個由明膠（GelMA）和合成納米硅酸鹽（Laponite）組成的相互滲透網(wǎng)絡(luò),，Laponite是輕度交聯(lián)的聚合物,，具有獨特的離子特性，可以促進細(xì)胞釋放的生物因子保留,，并協(xié)助旁分泌信號傳導(dǎo),。低GelMA（5%）與高Laponite（2.5-3.5%）復(fù)合水凝膠和高GelMA（10%）與低Laponite（1.0-2.0%）復(fù)合水凝膠3D打印機械性能都在可接受范圍內(nèi)。但是高Laponite含量的低GelMA復(fù)合水凝膠無法提供細(xì)胞生存能力,。隨著Laponite比例的增加,，細(xì)胞更加聚集，形成更大的3D腫瘤結(jié)構(gòu),。RT-qPCR和Western blot實驗顯示,，Laponite比例的增加會誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中生長因子和組織重塑相關(guān)基因以及蛋白質(zhì)的上調(diào)。相反,，細(xì)胞周期和增殖相關(guān)的基因下調(diào),。另一方面，對于成纖維細(xì)胞,，Laponite比率的增加也會導(dǎo)致與間質(zhì)相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)整體上調(diào),。

圖2 GelMA/Laponite復(fù)合水凝膠可打印性表征

在基于擠壓的生物打印過程中，由于內(nèi)噴嘴直徑、壓力,、打印速度,、溫度和促凝劑成分等可以控制和影響打印纖維形態(tài)。作為優(yōu)化生物打印過程的第一步,，設(shè)定了噴嘴壓力（30G）,、溫度（23℃）和打印速度（5毫米/秒）。改變GelMA/Laponite水凝膠的成分,，控制打印壓力（50kPa到 80千帕）,。將單層結(jié)構(gòu)打印在聚苯乙烯培養(yǎng)皿上，光學(xué)顯微鏡成像顯示隨著Laponite比例的增加,，打印出的GelMA/Laponite纖維整體厚度和形狀都在不斷變化,。接著，評估了復(fù)合水凝膠的可打印性,。在0.0-3.5%Laponite與兩種GelMA比例（5%,，10%）之間，當(dāng)GelMA的百分比較低（5%）,，而Laponite的含量低于2.0%時,，粘性就會降低。而低于2.0%時,，粘度太低,，無法保持幾何形狀。另一方面,，當(dāng)GelMA百分比較高（10%）,，而Laponite的百分比超過2.5%時,，粘度過高,，無法擠出。進行打印保真度,、物理和化學(xué)特性（如流體力學(xué),、硬度、溶脹性和降解等）分析都顯示出Laponite對3D生物打印具有積極影響,。

圖3 載有細(xì)胞的GelMA/Laponite復(fù)合水凝膠體外生物相容性以及胰腺癌細(xì)胞混入凝膠后形態(tài)學(xué)

研究人員為了建立一個癌細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞共存類器官腫瘤模型,，使用含有腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的GelMA/Laponite復(fù)合水凝膠進行3D生物打印。接著通過活/死細(xì)胞染色（直接存活率）和代謝活動（間接線粒體）來分析了MIA PaCa-2細(xì)胞在水凝膠內(nèi)的存活率,，培養(yǎng)7天和10天后,，復(fù)合水凝膠組之間細(xì)胞增殖出現(xiàn)差異，但是所有組中都有大量活力旺盛的細(xì)胞,。高Laponite含量的G5Lx組比單純G5Lx組有相對較少的活細(xì)胞,。G10Ly組的細(xì)胞在3D生物打印結(jié)構(gòu)內(nèi)增殖長達(dá)7天，形成細(xì)胞聚集團。而G5Lx組有較少的細(xì)胞,，而且以分散和不連續(xù)的方式分布,。10天后進行線粒體活性分析發(fā)現(xiàn)Laponite會影響細(xì)胞生長。6%的Laponite生物墨水可用于3D生物打印小鼠成骨細(xì)胞系,，并保持7天活力,。因此基于Laponite的支架可以作為組織工程的骨架使用。

總結(jié)與展望
本文開發(fā)了一種納米離子共價交聯(lián)的生物墨水,，用來構(gòu)建3D生物打印類器官腫瘤模型,。Laponite通常用做組織工程中剪切稀化的材料，具有獨特的離子電荷,，可以增加組織工程中釋放的生物因子的保留率,，并協(xié)助旁分泌信號的產(chǎn)生。本研究結(jié)果中,，復(fù)合水凝膠與低Laponite具有較高的生物相容性,，改善了流體學(xué)和機械性能。此外GelMA/Laponite水凝膠有效促進了MIA PaCa-2細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖,，提供了一個較好的微環(huán)境,。Laponite比率的變化會導(dǎo)致腫瘤相關(guān)基因和成纖維細(xì)胞相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平的顯著變化。GelMA/Laponite復(fù)合生物墨水引起癌細(xì)胞的微環(huán)境重塑,，并導(dǎo)致基因的上調(diào),，這些基因可以促進脫髓鞘成纖維細(xì)胞和CM在3D生物打印類器官腫瘤模型積累�,？傊瓽elMA/Laponite復(fù)合水凝膠的機械性能可以進行打印,，同時該體系能改善腫瘤細(xì)胞/間質(zhì)細(xì)胞的相互作用，促進細(xì)胞的生存,、增殖和發(fā)展,。該研究未來將大力促進類器官腫瘤模型的構(gòu)建。

文章來源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ace0db