類器官培養(yǎng),，微陣列3D生物打印技術(shù)AHM+1！

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類器官通過(guò)提供類似于體內(nèi)的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能有可能徹底改變體外疾病建模,。然而,，由于繁瑣的類器官分化過(guò)程和難以擴(kuò)大培養(yǎng)及質(zhì)量控制的困難,，這種不斷創(chuàng)新和發(fā)展的技術(shù)仍然需要分析通量和可重復(fù)性，以實(shí)現(xiàn)化合物的高通量篩選（HTS）,。由于缺乏與相對(duì)較大的類器官兼容且易于使用的流體系統(tǒng),，將類器官用于HTS受到進(jìn)一步挑戰(zhàn)。在這里,，美國(guó)北德克薩斯大學(xué)Moo-Yeal Lee與辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)療中心Takanori Takebe,、 James M. Wells通過(guò)“微陣列三維（3D）生物打印”技術(shù)以及用于人體類器官培養(yǎng)和分析相關(guān)柱和灌注板來(lái)克服這些挑戰(zhàn)。將高精度,、高通量干細(xì)胞打印和封裝技術(shù),、柱板與互補(bǔ)的深孔板和灌注孔板相結(jié)合用于靜態(tài)和動(dòng)態(tài)類器官培養(yǎng)。將水凝膠中的生物打印細(xì)胞和球狀體分化為肝和腸類器官,，用于原位功能分析,。柱狀/灌注板與標(biāo)準(zhǔn)的384孔板和HTS設(shè)備兼容，因此在目前的藥物發(fā)現(xiàn)工作中易于采用,。

相關(guān)研究?jī)?nèi)容以“A Pillar and Perfusion Plate Platform for Robust Human Organoid Culture and Analysis”為題于2023年8月24日發(fā)表在《Advanced Healthcare Materials》,。

圖1 微陣列3D生物打印技術(shù)及相關(guān)柱及灌注板平臺(tái)

由于開(kāi)發(fā)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)無(wú)法滿足需求，本研究開(kāi)發(fā)了微陣列3D生物打印技術(shù)和相關(guān)的柱/灌注板,。微陣列3D生物打印是一種微電磁閥驅(qū)動(dòng),、高精度的機(jī)器人細(xì)胞打印技術(shù)，可以以最小的人工干預(yù)快速,、重復(fù)地創(chuàng)建人體類器官（圖1）,。

圖2 柱板和深孔板的組合用于靜態(tài)類器官培養(yǎng)

一個(gè)384柱板包含384個(gè)柱，使用3D生物打印機(jī)或多通道移液管分配懸浮在水凝膠中的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）（圖2）,。柱間距4.5 mm,，柱高11.6 mm的384柱板是通過(guò)注塑成型制成的（圖2A）�,？组g距4.5 mm,、寬3.5mm、深14.7 mm的384深孔板采用注塑制造（圖2B）,。

圖3 將柱板和灌注孔板相結(jié)合進(jìn)行動(dòng)態(tài)類器官培養(yǎng)

除了384柱板和384深孔板,，36柱板和36灌注板都建立在傳統(tǒng)的384孔板上，用聚苯乙烯注射成型進(jìn)行動(dòng)態(tài)類器官培養(yǎng)（圖3）,。模擬36灌注板中夾有36柱板的灌注孔和儲(chǔ)層水位隨時(shí)間的變化,，以避免溢流（圖3F）。在灌注孔的柱下發(fā)現(xiàn)高速分布,，這可能導(dǎo)致柱下的高流體混合,，并加速柱上的細(xì)胞生長(zhǎng)（圖3G、I）,。

圖4 柱板上的生物打印人肝臟類器官（HLOs）

為了成功地將iPSCs分化為類器官并證明其在柱/灌注板中的功能,，選擇不同分化階段的iPSCs,、仿生水凝膠和含有特定生長(zhǎng)因子和添加劑的生長(zhǎng)介質(zhì)是至關(guān)重要的。本研究證明了人肝類器官（HLOs）和人腸類器官（HIOs）分別從懸浮在柱板上的海藻酸鹽和基質(zhì)膠混合物中的前腸細(xì)胞和柱板上的中后腸細(xì)胞球體中的分化,。從形態(tài)學(xué)上看,，在柱板和24孔板上培養(yǎng)的HLOs與內(nèi)腔被間充質(zhì)細(xì)胞包圍的圓形上皮細(xì)胞層相似（圖4A、B）,。成熟的HLOs大小為0.1~0.2mm,；維甲酸（RA）處理后，維甲酸基質(zhì)膠（對(duì)照）的間充質(zhì)細(xì)胞正常生長(zhǎng),，而海藻酸鹽和基質(zhì)膠混合物的間充質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)顯著減少（圖4C）,。

圖5 柱板上靜態(tài)培養(yǎng)的HLOs功能

通過(guò)評(píng)估類器官形態(tài)、白蛋白分泌和肝臟生物標(biāo)志物的免疫熒光染色比較冷凍前腸細(xì)胞在水凝膠打印在24孔板中分化的HLOs,。白蛋白分泌數(shù)量在三個(gè)不同的條件下幾乎是相同的（圖5A）,。在36柱板上生成HLOs后，通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)到HLOs中肝細(xì)胞標(biāo)記物肝細(xì)胞核因子-4α（HNF4α）和上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-鈣粘蛋白的表達(dá)（圖5B）,。在柱板上培養(yǎng)的HLOs（圖5B中間）與在24孔板上培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)板中培養(yǎng)的表達(dá)沒(méi)有差異（圖5B為底部）,。除了白蛋白的分泌外，通過(guò)測(cè)量36柱板上的膽汁酸攝入量,，證明了HLOs的顯微解剖特征（圖5C）,。

圖6 用化合物處理柱板上靜態(tài)培養(yǎng)的HLOs

通過(guò)將HLOs暴露于36灌注板中的脂肪酸72小時(shí)，成功地模擬脂肪性肝炎（圖6A-C）,。通過(guò)BODIPY-based脂質(zhì)染色和圖像分析評(píng)估HLOs中脂質(zhì)積累的能力（圖6A）,。進(jìn)一步的高倍共聚焦成像顯示，經(jīng)油酸處理后,，HLOs的細(xì)胞質(zhì)中積累了脂質(zhì)滴（圖6B,、C）。為了評(píng)估藥物誘導(dǎo)的肝損傷（DILI）,，將帶有HLOs的36柱板夾在含有萘法唑酮的36灌注板上孵育72小時(shí)（圖6D-F）,。藥物暴露后，通過(guò)將36柱板分離并將其夾在一個(gè)含有鈣綠素AM和乙型二聚體-1的384深孔板上來(lái)測(cè)量HLOs活力（圖6E）,，柱子上的綠點(diǎn)和紅點(diǎn)分別代表活細(xì)胞和死細(xì)胞,，萘法唑酮濃度的增加導(dǎo)致細(xì)胞活力下降。使用細(xì)胞滴度-Glo®發(fā)光細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒測(cè)定萘法唑酮的劑量反應(yīng)曲線和半抑制濃度值,，結(jié)果顯示細(xì)胞活力以萘法唑酮的劑量依賴性方式下降（圖6F）,。

圖7 通過(guò)將單個(gè)中后腸細(xì)胞球狀體從超低附著體（ULA）384孔板轉(zhuǎn)移到384柱板上，人腸類器官（HIOs）在柱板上均勻分化

中后腸細(xì)胞球狀體在40天的過(guò)程中分化為HIOs（圖7A）,。HIO在柱板上分化成熟40天后,，在柱板上建立類器官原位成像，顯示腸上皮發(fā)育和細(xì)胞-細(xì)胞緊密連接形成（圖7B、C）,。在靜態(tài)培養(yǎng)中，正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HIOs分泌非常一致,，且具有高度重復(fù)性（圖7D）,。而HIOs在36柱板上培養(yǎng)4周后，柱板上8 ~14 %的HIOs因蛋白酶分泌的基質(zhì)凝膠降解而分離,，5~11 %的中后腸聚集物由于細(xì)胞數(shù)量少而沒(méi)有正常分化為HIOs（圖7E）,。即使當(dāng)附著在柱板上的HIOs的CV值低于25%時(shí)，也能實(shí)現(xiàn)均勻生長(zhǎng)（圖7D,、F),。為了研究HIOs是否對(duì)像人類腸道一樣的營(yíng)養(yǎng)水平有反應(yīng)，使用36柱板/36灌注板系統(tǒng)來(lái)動(dòng)態(tài)控制柱上葡萄糖水平,，從3mM（禁食）到20mM（喂養(yǎng)）（圖7G）,。這些結(jié)果表明，可以通過(guò)將球狀體轉(zhuǎn)移到柱板上,，并通過(guò)原位成像或使用簡(jiǎn)單的流體方式實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)類器官,，從而可擴(kuò)展地生成均勻類器官。

綜上,，本研究通過(guò)聚苯乙烯注射成型成功制造柱/灌注板,，并通過(guò)功能分析演示靜態(tài)和動(dòng)態(tài)的HLO和HIO培養(yǎng)。柱/灌注板通過(guò)支持深孔板中生長(zhǎng)介質(zhì)的靜態(tài)培養(yǎng)或生長(zhǎng)介質(zhì)通過(guò)灌注孔板的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)維持生物打印單細(xì)胞懸浮在海藻酸鹽和基質(zhì)凝膠的混合物中,，以及基質(zhì)凝膠中的細(xì)胞球體的長(zhǎng)期類器官培養(yǎng),。開(kāi)發(fā)的細(xì)胞打印和封裝方案具有高度的靈活性，允許在柱板上的基質(zhì)凝膠中培養(yǎng)多種類器官,，從而為化合物潛在的器官特異性毒性提供了更多的見(jiàn)解,。本研究在柱/灌注板上展示的微陣列3D生物打印技術(shù)代表了一種獨(dú)特的策略，即快速地在仿生水凝膠中打印PSCs和類器官,。柱/灌注板平臺(tái)上的類器官可以通過(guò)模擬體內(nèi)微環(huán)境再現(xiàn)組織發(fā)育并維持高組織功能,。此外，可以通過(guò)高通量,、高含量的類器官分析在體外進(jìn)行復(fù)制和闡明化合物的組織功能和機(jī)制作用,。將生物打印的類器官與高含量的全類器官成像相結(jié)合，以更好地了解生成的類器官的功能和化合物的細(xì)胞毒性,。因此,，微陣列生物3D打印技術(shù)可以解決類器官研究中未滿足的需求，通過(guò)結(jié)合柱板上PSCs的快速打印,，在靜態(tài)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)中分化和成熟為類器官,，模擬人體組織的生理微環(huán)境，同時(shí)顯著提高吞吐量和可操作性，以預(yù)測(cè)化合物的篩選,。本研究設(shè)想在柱/灌注板中生物打印的類器官可以為化合物的臨床前評(píng)估或優(yōu)先考慮環(huán)境毒物提供高度預(yù)測(cè)的毒性和有效性信息,。因此，本研究中獨(dú)特的方法可以為HTS的類器官檢測(cè)提供廣泛的工業(yè)應(yīng)用,。

文章來(lái)源：
https://doi.org/10.1002/adhm.202302502