3D打印水凝膠治療糖尿病傷口：南大和南工大攜手登頂子刊

來源： EFL生物3D打印與生物制造

糖尿�,。―M）是一種慢性代謝性疾病,，影響著全球近 4.63 億成年人,。隨著人口年齡的增長,，糖尿病的發(fā)病率也在不斷上升,。大約四分之一的糖尿病患者會出現(xiàn)糖尿病足潰瘍（DFU）,，五年死亡率為 30.5%,，與癌癥（31%）的死亡率相接近。糖尿病足潰瘍與慢性疼痛,、自我護理能力下降,、長期感染、足部截肢的高風險以及全球約 85 億美元的沉重經(jīng)濟負擔有關,。脫位療法,、負壓療法、手術清創(chuàng)和抗生素等保守療法往往無法取得令人滿意的療效,，而且還會產(chǎn)生不良反應,。高糖誘導的血管內(nèi)皮損傷是糖尿病傷口不愈合的一個主要病理因素。

為了阻斷這一病理過程,，來自南京工業(yè)大學的遲波和南京大學的吳秀文,、任建安團隊合作設計了一種全肽可打印水凝膠平臺，該平臺基于硫醇化γ-聚谷氨酸、甲基丙烯酸縮水甘油酯共軛γ-聚谷氨酸和硫醇化精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的高效,、精確的一步點擊化學反應,。血管內(nèi)皮生長因子 165 過度表達的人臍靜脈內(nèi)皮細胞就是利用這一平臺打印出來的，從而制造出具有高細胞活力和精確細胞空間分布控制的活體材料,。這種含有細胞的水凝膠平臺可加速大鼠糖尿病傷口的愈合,，因為血管內(nèi)皮生長因子 165 可持續(xù)釋放，促進血管生成,，減輕對血管內(nèi)皮線粒體的損傷,，從而減少組織缺氧，降低炎癥反應,，促進細胞外基質(zhì)重塑,。總之,，這項研究為制造組織友好,、高效、精確的三維打印全肽水凝膠平臺提供了一種用于細胞遞送和自我更新生長因子療法的可行策略,。相關工作以題為“A click chemistry-mediated all-peptide cell printing hydrogel platform for diabetic wound healing”的文章發(fā)表在2023年11月29日的國際頂級期刊《Nature Communications》,。

1. 創(chuàng)新型研究內(nèi)容

本研究利用硫醇化γ-聚谷氨酸（γ-PGA-SH）、甲基丙烯酸縮水甘油酯共軛γ-聚谷氨酸（γ-PGA-GMA）和硫醇化精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸（RGDC）序列設計了一種細胞可打印水凝膠平臺,，其中 RGDC 是一種支持細胞粘附和擴散的整合素受體（圖 1A,，B）。該平臺是通過一步凝膠化法構建的,，具有硫醇-烯點擊反應高效,、精確等固有特點（圖 1C）。由此產(chǎn)生的肽基水凝膠平臺有望成為高效的細胞和生長因子輸送載體,，并創(chuàng)造出一種近似皮膚組織理化特性的活體材料,。此外，本研究用攜帶 VEGF 165 轉(zhuǎn)錄本的慢病毒將人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）基因修飾為HUVECsvegf165+,，以進行過表達（圖 1D）,。與加載生長因子的傳統(tǒng)策略不同，通過 DLP 打印將細胞加載到水凝膠平臺后,，作為細胞載體的 HUVECsvegf165+ 負責 VEGF 165 的連續(xù)生成,。雖然之前的研究表明血管內(nèi)皮生長因子對糖尿病傷口愈合有效，但其潛在機制并不完全清楚,，主要歸因于組織血管生成,。本研究清楚地闡明了 VEGF 165 的信號轉(zhuǎn)導機制，它能阻礙 Bax 誘導的線粒體膜（MMs）孔形成,，從而改善內(nèi)皮細胞凋亡并保留血管生成的潛力,。然后，利用糖尿病大鼠模型，全面評估了這種含有細胞的水凝膠平臺在糖尿病傷口愈合中的療效（圖 1E）,，包括傷口閉合率、血管生成,、上皮化,、疤痕風險、毛發(fā)形成,、基質(zhì)細胞代謝,、組織缺氧和炎癥。

圖1 設計的細胞可打印多肽水凝膠平臺,，可生產(chǎn)可用于糖尿病傷口愈合的自我更新的血管內(nèi)皮生長因子 165

【設計并優(yōu)化了一步光固化全肽水凝膠】

γ-PGA-GMA是通過γ-PGA和GMA的環(huán)氧開環(huán)反應合成的,。1H 核磁共振（NMR）和傅立葉變換紅外（FTIR）光譜證實了γ-PGA-GMA 的合成。如圖 2A 所示,，γ-PGA-GMA 的光譜在 6.27 ppm（a）和 5.64 ppm（b）處出現(xiàn)了兩個新峰,，這兩個峰都對應于 GMA 的乙烯基（C = C）的質(zhì)子。將 5.64-6.27 ppm 的乙烯基信號積分面積與 4.13-4.52 ppm 的甲基質(zhì)子信號積分面積（c）進行比較,，計算出 GMA 的取代度為 28%,。在傅立葉變換紅外光譜（圖 2B）中，γ-PGA-GMA 出現(xiàn)了 1637 cm-1 的吸收峰,，該吸收峰歸因于 GMA 的乙烯基,，從而進一步驗證了共軛的成功。將γ-PGA-GMA,、γ-PGA-SH,、RGDC 和光引發(fā)劑 LAP 簡單混合，就能生產(chǎn)出基于硫醇-烯點擊反應的水凝膠,。點擊反應是指通過雜原子連接（C-X-C）,，開發(fā)一套快速、高可靠性,、高產(chǎn)率和高選擇性的反應,，用于快速合成有用的新化合物和組合庫。為了研究凝膠化的可行性并優(yōu)化水凝膠的物理性質(zhì),，本研究利用了不同組成（4.5,、5.0、5.5 和 6.0 w/v%）的 γ-PGA-GMA 和 γ-PGA-SH,，并隨著聚合物濃度的增加分別命名為凝膠 1,、凝膠 2、凝膠 3 和凝膠 4,。由于凝膠 2 的儲存模量（G′）的變化與光的開和關的控制密切相關,，因此在藍光（n = 405 nm）照射下水凝膠可以快速交聯(lián)（圖 2C）。與本研究團隊之前報道的基于γ-PGA 的水凝膠相比，在預凝膠混合物中加入 LAP 大大縮短了凝膠化時間,，從 7 分鐘以上縮短到 20 秒以內(nèi),，大大節(jié)省了材料，因此這種凝膠配方更適合作為光固化印刷的生物墨水,。

圖2 全肽水凝膠的合成與優(yōu)化

【基于全肽水凝膠的高效精準 DLP 打印平臺的開發(fā)】

如圖 3A 所示,，本研究設計并測試了一個用作打印原型的扁平圓柱體，每層分別暴露在藍光下 16,、24,、32 或 40 秒。每層光照射時間的延長導致總打印時間增加,，效率降低（圖 3B）,。不過，適當延長光照射時間可使相鄰平面的切角接近 90°,，從而提高圓柱體的打印精度（圖 3C）,。隨著 G′的增加，光照時間的延長也提高了所制備水凝膠的機械強度（圖 3D）,�,？紤]到打印速度、精度和機械性能之間的平衡,，本研究選擇了 32 秒的光照時間,。然后，本研究將打印層厚度從 0.1 毫米調(diào)整到 0.4 毫米（圖 3E）,。層厚的增加大大縮短了打印時間（圖 3F）,。此外，由于層厚增加時相鄰平面的切角偏離 90°較遠,，打印精度略有下降（圖 3G）,。當層厚度增加時，印刷水凝膠的機械強度下降（圖 3H）,�,？紤]到打印效率、精度和機械性能,，本研究選擇 0.2 毫米的層厚進行以下實驗,。

為了進一步確定 DLP 印刷水凝膠的分辨率，本研究設計了一個梳子模型,，相鄰梳齒的梯度距離從 3 毫米到 0.25 毫米不等（圖 3I）,。梳子模型被精細地打印在平臺上，表面粘有少量未交聯(lián)的生物墨水,。將梳子浸入水中去除多余的生物墨水后,，梳齒的間距就能更好地觀察到,，直到間距縮短到 0.5 毫米時，梳齒才能被抬起,。當間隔距離設定為 0.25 毫米時,，梳齒之間的間隙消失了。這些結果意味著印刷分辨率可以達到 0.5 毫米（圖 3J）,。為了確定打印誤差范圍,，本研究設計了一個微管壁厚為 0.5 毫米的微管陣列。打印完成后,，使用異硫氰酸熒光素（FITC）對微管壁進行染色，在共聚焦顯微鏡下測得微管壁厚度為 0.622 毫米,。因此,，計算出的打印誤差為 0.122 毫米（圖 3K）。這一結果可以解釋梳齒間隙在 0.25 mm 間隔內(nèi)消失的原因,，因為相鄰梳齒的打印誤差范圍累計接近 0.25 mm,。根據(jù) DLP 打印γ-PGA 水凝膠的分辨率和保真度，打印出了不同形狀的物體,，如六角形花瓣,、微孔支架和耳朵模型（圖 3L）。

圖3 全肽水凝膠的 DLP 可印刷性

【使用全肽生物墨水共同印制 HUVECsvegf165+,，細胞存活率和增殖情況令人滿意】

本研究構建了感染 HUVEC 的特異性慢病毒質(zhì)粒（pHS-AVC-1580）,，其中含有編碼 NheI 和 PvuII 限制性內(nèi)切酶、mNeongreen 綠色熒光蛋白（GFP）,、中和嘌呤霉素的嘌呤霉素 N-乙酰轉(zhuǎn)移酶和 VEGF 165 的轉(zhuǎn)錄本（圖 4A）,。無 VEGF 165 轉(zhuǎn)錄本的慢病毒質(zhì)粒（pHS-AVC-ZQ328）用作對照。經(jīng) NheI 和 PvuII 消化后,，通過基因測序和 DNA 電泳驗證了過表達 VEGF 165 的慢病毒質(zhì)粒的基因序列和結構,。圖 4B 證實了 VEGF 165 轉(zhuǎn)錄本信號的存在，圖 4C 顯示質(zhì)粒片段在消化后符合預期大小,。在感染對照組和 VEGF 165 高表達慢病毒并用嘌呤霉素選擇后,，本研究成功生成了 HUVECsvector 和 HUVECsvegf165+，其中 GFP+ 細胞的比例高達 90%以上,。與 HUVECsvegf165+ 中的 VEGF 信號相比,，HUVECsvegf165+ 中的 VEGF 信號明顯增加。將 HUVECsvegf165+（1×105 個細胞/毫升）與全肽生物墨水共同印制成扁平的圓柱形細胞片,。細胞片培養(yǎng)后,，在 IVIS 光譜成像下，GFP 強度逐漸提高（圖 4D,、E）,，這意味著細胞轉(zhuǎn)錄活性得以維持,，細胞數(shù)量可能增加。為了進一步確定細胞的增殖情況,，使用共聚焦顯微鏡對細胞片進行了 Z 軸堆疊,，結果顯示細胞數(shù)量有所增加（圖 4F）。此外,，細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）檢測也證實了細胞片中 HUVECsvegf165+ 的明顯增殖（圖 4G）,。

圖4 使用全肽生物墨水共同印制 HUVECsvegf165+

【HUVECsvegf165+負載的水凝膠以自我更新的方式釋放血管內(nèi)皮生長因子165，促進體外血管生成,，并通過抑制Bax誘導的線粒體穿孔保護內(nèi)皮細胞免受HG誘導的損傷】

通過載入活細胞,，本研究認為 HUVECsvegf165+ 水凝膠是一種活材料，具有顯著的 VEGF 165 自我更新能力,，而 VEGF 165 是 VEGFA 的剪接變體,，可以分泌到細胞外。為了驗證這一點,，本研究比較了負載 HUVECsvegf165+ 的水凝膠,、負載 HUVECvector 的水凝膠和負載 VEGF 165 重組蛋白的水凝膠的 VEGF 165 釋放動力學。HUVECsvegf165+ 水凝膠釋放的 VEGF 165 量遠高于 HUVECvector 水凝膠,。刷新培養(yǎng)基后,，負載 VEGF 165 的水凝膠的 VEGF 165 釋放量明顯減少，但負載細胞的水凝膠的 VEGF 165 釋放曲線與刷新培養(yǎng)基前基本一致,�,？傊�，這些實驗表明,，HUVECsvegf165+負載的水凝膠能以自我更新的方式釋放血管內(nèi)皮生長因子 165,，從而增強旁分泌作用。為了進一步研究 HUVECsvegf165+ 水凝膠釋放的可自我更新的 VEGF 165 的生物學功能,，本研究利用 transwell 小室系統(tǒng)建立了一個共培養(yǎng)細胞模型,，將細胞負載的水凝膠置于上腔，HUVECs 被接種于下腔（圖 5B）,。與添加 HUVECsvegf165+ 的水凝膠相比,，添加 HUVECsvegf165+ 的水凝膠能促進傷口愈合（圖 5C、D）,、細胞增殖（圖 5E）和 HUVEC 在底腔形成管（圖 5F-H）,。

圖5 不同水凝膠平臺釋放血管內(nèi)皮生長因子 165 的動力學及其產(chǎn)生的生物功能

由于 DM 總是伴隨著 HG 引起的血管內(nèi)皮細胞損傷，本研究進一步關注了 HUVECsvegf165+ 水凝膠對 HG 誘導的細胞損傷的影響,。圖 6A 顯示,，HG（尤其是 40 mM 的濃度）可導致 HUVEC 死亡。而在 5 mM 葡萄糖和 35 mM D-mannitol 的滲透壓控制下,，細胞活力并沒有受到影響,。然后,，本研究收集了HUVECsvegf165+負載水凝膠和HUVECvector負載水凝膠的細胞上清液，并將葡萄糖濃度調(diào)整為40 mM來處理HUVEC（圖6B）,。結果表明,，HUVECsvegf165+負載的水凝膠釋放的較高數(shù)量的 VEGF 165 緩解了 HG 誘導的細胞死亡（圖 6C），并減少了細胞氧化應激引發(fā)的活性氧（ROS）產(chǎn)生（圖 6D）,。

圖6 HUVECsvegf165+ 水凝膠可自我更新的血管內(nèi)皮生長因子 165 可通過保護線粒體通透性改善 HG 誘導的內(nèi)皮細胞損傷

【含有 HUVECsvegf165+ 的水凝膠可促進大鼠糖尿病傷口的愈合】

本研究按照圖 7A 所示的實驗方案評估了 HUVECsvegf165+ 水凝膠對大鼠糖尿病傷口的治療效果,。大鼠糖尿病傷口模型的建立是通過腹腔注射 70 mg/kg 劑量的鏈脲佐菌素（STZ），然后手術切除直徑 1 厘米的全厚皮膚,。與未注射 STZ 的正常對照組大鼠相比,，DM 模型在整個實驗過程中表現(xiàn)為血糖升高、體重增長遲緩和耗水量增加,。水凝膠組,、含有 HUVECvector 的水凝膠組和含有 HUVECsvegf165+ 的水凝膠組的 DM 三項指標均無顯著差異。第 3 天,、第 7 天、第 14 天和第 21 天是采集組織的時間點,，對應于傷口修復的炎癥,、增殖和組織重塑階段61�,；��� DLP 打印技術,，水凝膠可根據(jù)傷口的不規(guī)則形狀進行定制（附圖 9A），并實現(xiàn)高產(chǎn)率,。不同組的傷口愈合過程如圖 7B 所示,，并在圖 7C 中再現(xiàn)。與使用水凝膠或含有 HUVECsvegf165+ 的水凝膠治療的大鼠相比,，含有 HUVECsvegf165+ 的水凝膠組大鼠的傷口閉合速度更快（圖 7D）,。所有組的水凝膠都在第 21 天前逐漸降解（圖 7E）。細胞負載水凝膠中的 VEGF 165 呈再生狀態(tài),，尤其是前四天的 HUVECsvegf165+ 水凝膠組（圖 7F）,。與體外研究結果一致，體內(nèi) HUVECsvegf165+ 水凝膠比 HUVECvector 水凝膠產(chǎn)生更多的 VEGF 165,。這意味著含有 HUVECsvegf165+ 的水凝膠是血管生成和傷口愈合所需的血管內(nèi)皮生長因子 165 的良好來源,。

圖7 評估負載 HUVECsvegf165+ 的水凝膠對大鼠糖尿病傷口的影響

【含有 HUVECsvegf165+ 的水凝膠可促進糖尿病傷口的上皮化、毛發(fā)形成,、無疤痕趨勢,、血管生成、細胞增殖和新陳代謝】

為了全面描述傷口愈合狀態(tài),，本研究進一步應用了多種組織染色技術,。再上皮化對傷口愈合非常重要,。本研究使用基底角質(zhì)細胞的標記細胞角蛋白 14（CK14）和棘層角質(zhì)細胞的標記細胞角蛋白 10（CK10）來評估第 7 天和第 14 天的再上皮化情況。如圖 8A 所示,，由于上皮層厚度遠遠超過正常皮膚的上皮層厚度,，上皮層侵占了傷口床，并表現(xiàn)出很強的增殖能力,。特別是在第 7 天,，HUVECsvegf165+負載水凝膠組的擴展上皮層厚度大于單純水凝膠組或 HUVECvector-負載水凝膠組，這表明 HUVECsvegf165+負載水凝膠早期激活了再上皮化,。相比之下,，在第 14 天，HUVECsvegf165+-負載水凝膠組的擴展上皮層厚度最小,，與正常皮膚相似,，表明該組上皮增殖到重塑的進展迅速。此外,，第 7 天和第 14 天,，表皮基底層毛囊的 K14 染色顯示，與水凝膠處理組和 HUVECsvegf165+負載水凝膠組相比,，HUVECsvegf165+負載水凝膠組的毛囊密度顯著增加（圖 8B）,。這些結果表明，VEGF 165 的增強和自我更新釋放可有效加速角質(zhì)細胞遷移和毛囊形成,，從而促進糖尿病傷口的再上皮化,。

圖8 不同治療方法下糖尿病傷口愈合過程的組織學分析

【蛋白質(zhì)組學發(fā)現(xiàn)，HUVECsvegf165+負載水凝膠改善糖尿病傷口愈合的效果與組織血管化和氧合,、細胞外基質(zhì)（ECM）重塑和炎癥調(diào)節(jié)有關】

為了概述增強的,、可自我更新的 VEGF 165 刺激所導致的分子信號變化，本研究進一步對使用 HUVECsvegf165+ 水凝膠處理后第 7 天的糖尿病傷口進行了蛋白質(zhì)組學檢測,。HUVECsvegf165+ 水凝膠組作為對照組,。總的來說,，HUVECsvegf165+負載水凝膠組和 HUVECvector負載水凝膠組之間有 500 個蛋白質(zhì)明顯上調(diào),，546 個蛋白質(zhì)明顯下調(diào)（圖 9A）。圖 9B 顯示了基于主成分分析（PCA）的兩組蛋白質(zhì)表達差異,，表明 HUVECs 過表達的 VEGF 165 在調(diào)節(jié)傷口修復過程中發(fā)揮了重要作用,。圖 9C 中的火山圖顯示了差異表達的蛋白質(zhì)。用相應基因名稱標記的上調(diào)蛋白與血管的發(fā)育,、形成和增大（如 Clic4,、Eng、Enpep,、Icam1,、Itga1,、Tgfbi、Cav1 和 LOC108348074）,、ECM 的增加（如 Efemp2,、Col12a1、Lama4 和 Lama5）以及細胞粘附性的增強（如 Vcan,、Sdc4,、Itgb1 和 Icam1）有關。下調(diào)的蛋白質(zhì)與炎癥標志物的減少有關,。本研究根據(jù)差異表達蛋白進一步進行了功能富集分析,，以揭示受 HUVECsvegf165+ 水凝膠影響的主要分子通路。從上調(diào)蛋白的生物過程富集分析（圖 9D）可以看出,，HUVECsvegf165+-負載的水凝膠顯著促進了 ECM 的組裝和組織,、動脈形態(tài)發(fā)生和內(nèi)皮細胞增殖。在下調(diào)蛋白的生物過程富集分析中（圖 9E）,，HUVECsvegf165+負載的水凝膠明顯抑制了白細胞聚集和活化,、中性粒細胞介導的免疫和 TNF 的產(chǎn)生。

圖9 HUVECsvegf165+ 負載水凝膠與 HUVECvector 負載水凝膠第 7 天糖尿病傷口的蛋白質(zhì)組學比較

據(jù)報道,，早期消除炎癥有利于無疤痕修復和傷口愈合,。為了進一步證實 HUVECsvegf165+ 水凝膠能減少炎癥這一發(fā)現(xiàn)，本研究在第 7 天評估了糖尿病傷口中的促炎細胞因子和趨化細胞因子,。如圖 10A 和圖 10B 所示,，與水凝膠組和 HUVECsvegf165+水凝膠組相比,，蛋白質(zhì)組剖析大鼠細胞因子陣列顯示,，HUVECsvegf165+-負載水凝膠組的各種促炎和趨化細胞因子，如 CINC-1,、CINC-2ɑ/β,、CINC-3、IL-1ɑ 和 LIX 的表達均有所下降,。此外,，在負載 HUVECsvegf165+ 的水凝膠組中，金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）的表達低于其他兩組,，而金屬蛋白酶抑制劑-1 能使金屬蛋白酶-9 失活,，阻礙組織重塑并促進增生性瘢痕的形成。這支持了組織學分析結果,，即HUVECsvegf165+ 水凝膠可促進組織重塑并降低疤痕風險,。由于 HUVECsvegf165+ 水凝膠的產(chǎn)生，糖尿病傷口的 VEGF 水平升高,。血管的形成為氧合提供了氧氣傳輸管道,，而氧合是決定組織缺氧,、炎癥和傷口愈合率的關鍵因素。因此,，本研究在第 4 天使用發(fā)光氧探針--三（4,7-二苯基-1,10-菲羅啉）二氯化釕（II）絡合物來測量糖尿病傷口的氧合情況,。如圖 10C 所示，HUVECsvegf165+-負載水凝膠組的氧信號更強,，這表明水凝膠持續(xù)釋放 VEGF 165 改善了傷口氧合,。相應地，低氧誘導因子-1ɑ（HIF-1ɑ）是氧張力的指標,，在整個傷口愈合過程中,，HUVECsvegf165+負載水凝膠組的轉(zhuǎn)錄水平較低（圖 10D）。

圖10 含有 HUVECsvegf165+ 的水凝膠可改善糖尿病傷口的氧合和炎癥反應

2. 總結與展望
根據(jù)本研究結果,，HUVECsvegf165+負載的水凝膠是處理糖尿病傷口的有效活體材料,。然而，打印分辨率和大鼠模型還存在局限性,。提高打印分辨率的潛在方法包括提高光源分辨率或添加特定生物大分子以抑制光引發(fā)過程中未暴露區(qū)域的自由基聚合,。此外，通過注射 STZ 制作的大鼠糖尿病傷口模型僅代表了人體復雜的糖尿病傷口病理生理學的一部分,；因此,，還需要在大型哺乳動物或患者身上進行更多試驗，以驗證治療效果并確定具體用法,。

文章來源：
https://www.nature.com/articles/s41467-023-43364-2