《Acta Biomater.》：3D打印彈性生物材料減輕體外血管生成過程中的壓縮現(xiàn)象

來源： EngineeringForLife

生物組織需要最佳的質(zhì)量運(yùn)輸來支持代謝平衡,。在生理上,，這是通過復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)的,，該網(wǎng)絡(luò)支持氧氣和重要代謝物的流入,，以及廢物的清除和旁分泌信號的循環(huán),。如果沒有這個龐大的網(wǎng)絡(luò)，組織就只能依靠擴(kuò)散運(yùn)輸,，而擴(kuò)散運(yùn)輸?shù)男�率通常只有幾百微��,。因此，在�?gòu)建工程組織或細(xì)胞療法時,，以有利于高效運(yùn)輸?shù)姆绞皆O(shè)計(jì)平臺對于支持其在體內(nèi)長期存活和移植至關(guān)重要,。大多數(shù)細(xì)胞植入成功的一個關(guān)鍵參數(shù)是形成完整而全面的植入體內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)。預(yù)血管化,，即移植前在體外生成血管結(jié)構(gòu),，可通過吻合加速植入物的灌注。然而,，這種技術(shù)的可擴(kuò)展性和整合的簡易性阻礙了臨床轉(zhuǎn)化,。在基于纖維蛋白的血管生成方法中，在血管樣結(jié)構(gòu)形成過程中,，脆弱的水凝膠基質(zhì)會發(fā)生重塑和降解,，導(dǎo)致細(xì)胞介導(dǎo)的構(gòu)建物快速壓縮，從而形成致密的毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu),，網(wǎng)絡(luò)覆蓋效果不佳,。

為了解決這些難題，來自美國佛羅里達(dá)大學(xué)的Cherie L. Stabler團(tuán)隊(duì)將血管生成水凝膠嵌入高多孔性,、生物穩(wěn)定性的3D聚二甲基硅氧烷（PDMS）支架中,。通過對3D打印模具進(jìn)行反向鑄造，支架呈現(xiàn)出高度互聯(lián)和可重復(fù)的孔隙結(jié)構(gòu),�,？紫洞笮∈峭ㄟ^對裝置內(nèi)血管生成的體內(nèi)篩選進(jìn)行優(yōu)化的。PDMS 框架與血管生成水凝膠的結(jié)合大大減少了纖維蛋白在體外的壓縮,，與單獨(dú)使用纖維蛋白水凝膠相比,，這種結(jié)構(gòu)易于操作，尺寸可預(yù)測,，表面積增大,。從整體上看，PDMS 框架改變了血管的形態(tài)發(fā)生,，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)明顯增大,，密度降低。血管生成蛋白質(zhì)組學(xué)評估顯示,，添加 PDMS 框架會對時間產(chǎn)生影響,，表明細(xì)胞增殖和遷移信號發(fā)生了改變。這項(xiàng)工作為改進(jìn)轉(zhuǎn)化前血管網(wǎng)絡(luò)的生成建立了一個平臺,，使其具有更大的靈活性,，以滿足臨床規(guī)模的工程組織需求,。相關(guān)工作以題為“3D Printed Elastomeric Biomaterial Mitigates Compaction During In Vitro Vasculogenesis”的文章發(fā)表在2023年9月20日的國際頂級期刊《Acta Biomaterialia》。

1. 創(chuàng)新型研究內(nèi)容
在開發(fā)這些高度組織化的硅樹脂支架時,，可重現(xiàn)的幾何特征被認(rèn)為是體內(nèi)血管生成和預(yù)血管網(wǎng)絡(luò)形成一致性的關(guān)鍵,。因此，本研究選擇了熔融沉積建模3D打印技術(shù),，因?yàn)樵摷夹g(shù)在微觀尺度上可重現(xiàn)幾何特征的能力已得到充分證明,，可定義明確的孔隙大小。利用建模創(chuàng)建了所需支架幾何形狀的“負(fù)”模,。隨后用水溶性 PVA 長絲打印出該模型,，以便在支架制作完成后移除（圖 1A-B）。然后將熱固化 PDMS 硅酮注入 PVA 模具的 “正”面空間,，在 PVA 模具水溶之前進(jìn)行交聯(lián)（圖 1C-D）,。利用這種反向鑄造方法，本研究制造出了兩種不同的支架孔隙幾何形狀：300 微米和 150 微米（圖 1 E-F）,。此外,，還制作了孔徑更大的 600 微米支架，但其機(jī)械穩(wěn)定性不足以進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞和植入研究,。

圖1 3D打印硅樹脂支架（3DPSS）的制作方法與評價

為了生成所需的前血管網(wǎng)絡(luò),，HUVEC 和 NHLF 細(xì)胞群被包裹在犧牲纖維蛋白水凝膠中。然后將這種水凝膠注入 3DPSS 平臺的開放孔中,，以確定支架包合是否能在不出現(xiàn)游離水凝膠中通常觀察到的劇烈壓縮的情況下形成網(wǎng)絡(luò)（圖 2A）,。本研究使用立體顯微鏡觀察了游離纖維蛋白水凝膠和 V-3DPSS 在 48 小時內(nèi)的整體壓縮情況，以確定支架包合的益處,。僅培養(yǎng) 12 小時后,，就觀察到有無支持性 3DPSS 的纖維蛋白水凝膠的壓縮度發(fā)生了明顯變化，游離纖維蛋白水凝膠和 V-3DPSS 的表面積相差 5.3 倍（分別為 16 ± 3.5 mm2 和 84.41 ± 3.86 mm2,；P < 0.0001）（圖 2B,、C）。24 小時后,，游離纖維蛋白水凝膠的表面積出現(xiàn)了非常顯著的下降（P < 0.0001,，下降了 2.6 倍），而 V-3DPSS 則保持不變（P = 0.082）,。48 小時后,，壓縮逐漸減弱，因?yàn)?V-3DPSS 和游離纖維蛋白水凝膠的表面積在 24 小時和 48 小時之間都沒有顯著變化,�,？傮w而言，雖然 V-3DPSS 在培養(yǎng) 2 天后表面覆蓋面積略有變化（6.8%）（P = 0.038）,，但 V-3DPSS 阻止了游離纖維蛋白水凝膠中出現(xiàn)的高達(dá)4.2 倍的減少,。

圖2 時間水凝膠壓縮和網(wǎng)絡(luò)表面積的成像和量化

研究表明,，壓縮在血管生成過程中發(fā)揮著重要作用，而且很可能是關(guān)鍵作用,；因此,，細(xì)胞組織的時間變化有望成為調(diào)節(jié)壓縮的結(jié)果。對自由培養(yǎng)或限制在 V-3DPSS 內(nèi)的纖維蛋白水凝膠中內(nèi)皮細(xì)胞自我組裝的時間變化進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn),，細(xì)胞組織發(fā)生了明顯變化。不出所料,，自由纖維蛋白水凝膠中的細(xì)胞經(jīng)歷了高度壓縮,，水凝膠表面積大幅縮小。此外,，在早期時間點(diǎn)還能觀察到細(xì)胞形態(tài)的顯著差異,。具體來說，在第 3 天,，兩組都出現(xiàn)了主要由單細(xì)胞組成的稀疏結(jié)構(gòu)（圖 3Ai,、3Ci）；然而,，與游離纖維蛋白水凝膠相比,，V-3DPSS 組（圖 3Di）的細(xì)胞表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞聚集，多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的質(zhì)量更高（圖 3Ai）,。到了第 5 天,，有更多的證據(jù)表明，游離纖維蛋白水凝膠（圖 3Bii）和 V-3DPSS （圖3Dii）中都出現(xiàn)了絲狀結(jié)構(gòu),。然而,，V-3DPSS 中的細(xì)胞仍主要表現(xiàn)為細(xì)胞集群模式，并從這些原生球體中延伸出芽狀結(jié)構(gòu),。到第 7 天,，兩組細(xì)胞都顯示出已建立的相互連接的網(wǎng)絡(luò)；然而,，血管網(wǎng)絡(luò)密度的視覺差異非常明顯,，游離纖維蛋白水凝膠與 V-3DPSS 相比，顯示出重疊和壓縮的分支網(wǎng)絡(luò)（圖 3B iii和圖 3D iii）,。

圖3 血管前網(wǎng)絡(luò)時間進(jìn)展成像

為了進(jìn)一步探究 PDMS 框架對纖維蛋白血管生成的影響,，本研究在培養(yǎng) 7 天后使用免疫熒光染色和共聚焦成像技術(shù)觀察了所生成網(wǎng)絡(luò)的微觀形態(tài)。通過肌動蛋白染色可觀察到游離纖維蛋白水凝膠含有高度緊密的細(xì)胞培養(yǎng)物（圖 4A i）,。如圖所示,，大量重疊的細(xì)胞給清晰成像帶來了挑戰(zhàn)，而且信號不會飽和,。僅聚焦于 CD 31+ 內(nèi)皮細(xì)胞（圖 4A ii）,，可觀察到具有高度連接形態(tài)的致密網(wǎng)絡(luò),。到第 7 天，純纖維蛋白水凝膠的橫截面也顯示出一個薄的高度致密的 CD 31+ 網(wǎng)絡(luò)（圖 4B i）,，并有證據(jù)表明存在類似管腔的中空結(jié)構(gòu)（圖 4CB ii）,。加入 PDMS 框架（V-3DPSS 組）后，網(wǎng)絡(luò)形態(tài)明顯不同,，整體細(xì)胞密度發(fā)生了視覺變化（圖 4C i）,。共培養(yǎng)的形態(tài)似乎符合支架的幾何形狀，填充了 3DPSS 的徑向和軸向孔隙,。以 CD 31+ 細(xì)胞為重點(diǎn)（圖 4C ii）,，在開放的框架內(nèi)觀察到連續(xù)的管狀結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)在 x 和 y 方向上圍繞孔纏繞,。值得注意的是,，V-3DPSS 的橫截面尺度和形態(tài)發(fā)生了明顯變化，整體上更厚的血管結(jié)構(gòu)包含更大,、更清晰的管腔狀結(jié)構(gòu)（圖 4D I 和 ii）,。

圖4 在第 7 天對游離纖維蛋白水凝膠和（V3DPSS）進(jìn)行免疫熒光染色和共聚焦成像的結(jié)果

本研究通過圖像分析對這些形態(tài)變化進(jìn)行量化。為了捕捉細(xì)胞空間密度的變化,，測量了構(gòu)建體開放空間內(nèi)細(xì)胞覆蓋的百分比（%）（圖 5Ai）,。與游離纖維蛋白水凝膠相比，在頂部平面（x-y）上,，V-3DPSS 的 CD 31+ 結(jié)構(gòu)覆蓋率總體下降了 29%,；但這一差異并不顯著（P < 0.122）（圖 5A ii）。為了描述培養(yǎng)一周后內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的厚度（z 維度）,，生成了共聚焦圖像的3D投影和深度圖,。支架框架對整個內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)厚度的影響非常明顯，與游離纖維蛋白水凝膠相比,，V-3DPSS 組增加了 3.6 倍（圖 5B ii,，P < 0.0001）。為了說明這些差異對網(wǎng)絡(luò)形態(tài)的影響,，對網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的平均直徑,、最大直徑和最小直徑進(jìn)行了量化（圖 5C）。不同培養(yǎng)條件下的圖像分析表明,，與游離纖維蛋白水凝膠相比,，V-3DPSS 組的平均結(jié)構(gòu)直徑顯著增加（P < 0.0001）（圖 5C ii）。此外,，V-3DPSS 組每個結(jié)構(gòu)的平均最大直徑顯著增加（P < 0.0001）（圖 5C iii）,，而平均最小直徑則未受到支架包被的顯著影響（P = 0.85）（圖 5C iv）。這些結(jié)果支持肉眼觀察到的 V-3DPSS 組網(wǎng)絡(luò)直徑增加和直徑多樣性增強(qiáng),。

圖5 在第 7 天確定整體網(wǎng)絡(luò)覆蓋,、網(wǎng)絡(luò)厚度和結(jié)構(gòu)直徑的圖像分析結(jié)果

有跡象表明,，支架的加入弱化了壓縮效果，影響了細(xì)胞的分布和形態(tài),，因此本研究利用廣泛的血管生成蛋白質(zhì)組學(xué)分析進(jìn)一步確定了細(xì)胞變化的背景,。在第 3 天和第 7 天測量了純纖維蛋白或 V-3DPSS 的蛋白質(zhì)陣列。蛋白質(zhì)陣列結(jié)果的匯總熱圖顯示為與純纖維蛋白第 3 天水平的折疊變化,，說明了支架和時間對共培養(yǎng)蛋白質(zhì)含量的影響（圖 6）,。與純纖維蛋白對照組相比，支架的存在僅在第 3 天影響了全局“血管生成”蛋白的表達(dá)（P = 0.041,；MANOVA）,，但這種影響在第 7 天消除（P = 0.539；MANOVA）,。此外，時間對 V-3DPSS 組是一個重要因素（P = 0.011）,，但對純纖維蛋白對照組不是（P = 0.193,；MANOVA）。對單個蛋白質(zhì)組影響的事后比較發(fā)現(xiàn),，在測試的組別或時間點(diǎn)之間,，沒有任何特定蛋白質(zhì)發(fā)生顯著變化，這表明蛋白質(zhì)組受到多種驅(qū)動因素的廣泛影響,。

圖6 高通量陣列量化共培養(yǎng)物內(nèi)蛋白質(zhì)的時間熱圖

通過確定各組培養(yǎng) 3 天和 7 天后所測蛋白質(zhì)的相關(guān)系數(shù),，本研究進(jìn)一步確定了血管生成蛋白質(zhì)組的特征。有了如此龐大的數(shù)據(jù)集,，確定哪些蛋白質(zhì)在數(shù)據(jù)集中具有廣泛的負(fù)相關(guān)性,，就能大范圍地推斷出封裝細(xì)胞的狀態(tài)以及不同組間隨著時間的推移如何進(jìn)行比較。通過計(jì)算第 3 天 V-3DPSS 組中表達(dá)的蛋白質(zhì)的相關(guān)系數(shù)（圖 7A）,，測得大多數(shù)蛋白質(zhì)之間總體呈正相關(guān),，但也有一些關(guān)鍵的例外情況；該數(shù)據(jù)集中呈負(fù)相關(guān)的蛋白質(zhì)包括絲裂蛋白 E1,、催乳素,、血管內(nèi)皮生長因子-C 和凝血因子 III。與 V-3DPSS 組相比,，對游離纖維蛋白水凝膠進(jìn)行同樣的分析也發(fā)現(xiàn)了類似的正相關(guān)蛋白質(zhì),；不過，與數(shù)據(jù)集負(fù)相關(guān)的蛋白質(zhì)群有所不同,，特別是 DPPIV,、內(nèi)皮素-1、TIMP-1,、凝血酶原-1,、血管生成素-1/2 和 FGF-7（圖 7C）,。對第 7 天相關(guān)系數(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，V-3DPSS（圖 7B）和游離纖維蛋白水凝膠（圖 7D）的蛋白質(zhì)組概況相似,，只有極少數(shù)蛋白質(zhì)與整個數(shù)據(jù)集呈負(fù)相關(guān),。V-3DPSS 網(wǎng)絡(luò)顯示 serpin E1、TIMP-1 和 thrombospondin-1 與數(shù)據(jù)集呈負(fù)相關(guān),，而游離纖維蛋白水凝膠具有與 V-3DPSS 相似的鑒定群體,，即 serpin E1、TIMP-1,、thrombospondin-1 和 DPPIV,。

圖7 顯示基于培養(yǎng)條件和時間的不同表達(dá)蛋白之間關(guān)系的皮爾遜相關(guān)矩陣

2. 總結(jié)與展望
可重復(fù)的3D打印高多孔支架促進(jìn)了體內(nèi)血管生成和體外預(yù)血管生成。在基于纖維蛋白的血管生成過程中加入3D PDMS 支架,，可有效減輕以前認(rèn)為網(wǎng)絡(luò)形成所必需的大尺度壓縮,，而不會影響血管樣網(wǎng)絡(luò)的形成。由此形成的厚構(gòu)造提供了一種可轉(zhuǎn)移的網(wǎng)絡(luò),，其網(wǎng)絡(luò)覆蓋范圍大大提高,，有可能用于基于細(xì)胞的組織工程療法。壓縮的減輕對宏觀和微觀形態(tài)都有影響,，結(jié)構(gòu)間距,、網(wǎng)絡(luò)厚度和結(jié)構(gòu)直徑都發(fā)生了明顯變化，從而增強(qiáng)了細(xì)胞在整個構(gòu)建體中的空間分布,。通過蛋白質(zhì)組學(xué)評估觀察到的整體蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)關(guān)系極化的時間變化,，凸顯了早期共培養(yǎng)動態(tài)的改變。這項(xiàng)工作強(qiáng)調(diào)了一種生成大規(guī)模預(yù)血管化網(wǎng)絡(luò)的方法,，具有提高工程組織存活率的轉(zhuǎn)化潛力,。未來的研究將側(cè)重于評估支架的加入對預(yù)血管網(wǎng)絡(luò)吻合和與共同移植的治療細(xì)胞整合的影響，以及進(jìn)一步研究孔徑大小對血管生成的作用,。

文章來源：https://www.sciencedirect.com/sc ... 23005652?via%3Dihub