3D打印仿真半月板支架結(jié)合自體滑膜移植有望克服半月板再生問題

來源：EngineeringForLife

半月板是膝關(guān)節(jié)內(nèi)復雜而重要的纖維軟骨組織,。目前半月板再生仍是一項較為困難的問題。近日,，來自北京大學的敖英芳,、程錦、胡曉青教授團隊進行了受半月板成熟和再生過程啟發(fā)的半月板再生技術(shù)的相關(guān)研究,。研究成果以“Meniscal fibrocartilage regeneration inspired by meniscal maturational and regenerative process”為題于11月08日發(fā)表在《Science Advances》上,。

本文利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型明確間充質(zhì)干細胞參與半月板的成熟和再生過程。同時受半月板成熟和再生過程啟發(fā),，研究人員開發(fā)了一種有效的轉(zhuǎn)化策略,，通過3D打印生物仿真半月板支架，結(jié)合自體滑膜移植,，促進半月板再生,。在大型動物模型中本文驗證了該方法可以促進各向異性半月板樣組織再生,，并保護軟骨免于退化,。從機制上講，生物支架的力學特性和基質(zhì)硬度上調(diào)Piezo1的表達,，促進鈣調(diào)素和NFATc1協(xié)同激活,，進一步激活YAP-pSmad2/3-SOX9軸，從而誘導間充質(zhì)干細胞形成纖維軟骨,，進一步促進半月板再生,。此外，力學特性和基質(zhì)硬度激活的Piezo1可進一步上調(diào)膠原交聯(lián)酶的表達,，從而催化膠原交聯(lián),，進而增強再生組織的機械性能。

本文從以下幾個方面進行詳細描述

1. 間充質(zhì)干細胞參與轉(zhuǎn)基因小鼠半月板成熟和再生過程

2. 3D打印PCL支架結(jié)合自體滑膜移植策略在大型動物模型中促進半月板再生并保護軟骨免于退化

3. 生物力學刺激通過YAP-pSmad2/3-SOX9軸誘導間充質(zhì)干細胞形成纖維軟骨

4. Piezo1通過協(xié)同激活鈣調(diào)素和NFAT介導機械傳導

5. 基質(zhì)硬度對YAP-pSmad2/3-SOX9軸的影響分析

6. 半月板再生過程中膠原交聯(lián)重塑分析

圖1 通過轉(zhuǎn)基因小鼠明確間充質(zhì)干細胞在半月板成熟和再生中的作用

為確定間充質(zhì)干細胞在半月板成熟過程中的作用,，本文使用轉(zhuǎn)基因小鼠進行鑒定,。血小板衍生生長因子α（Pdgfrα）陽性間充質(zhì)干細胞表達tdtomato蛋白（紅色熒光蛋白（RFP））。小鼠出生后8周開始使用他莫昔芬誘導1周,，10周取出小鼠膝關(guān)節(jié),。免疫熒光染色顯示，半月板中存在RFP/SOX9/Collagen I (COL I)/COL II陽性細胞,。表明間充質(zhì)干細胞在出生后8至10周時間內(nèi)分化為半月板纖維軟骨細胞,。出生后10周間充質(zhì)干細胞在仍存在半月板中。因此,，間充質(zhì)干細胞參與小鼠半月板的成熟過程,。之前研究表明，小鼠等小動物模型具有相對較強的體內(nèi)愈合能力,。小動物可能是研究半月板再生過程的合適模型,。為研究間充質(zhì)干細胞在半月板再生中的作用,，在對Pdgfrα-CreER; Rosa26-LSL-Tdtomato轉(zhuǎn)基因小鼠誘導后，接著對內(nèi)側(cè)半月板行半月板全切或次全切,。術(shù)后3月,，通過組織染色發(fā)現(xiàn)大量富含糖胺聚糖（GAG）、COL I和COL II的再生半月板纖維軟骨樣組織,。此外,，再生組織中還出現(xiàn)RFP/COL I/COL II/SOX9陽性細胞。表明間充質(zhì)干細胞參與半月板的再生過程,，分化為半月板纖維軟骨細胞,。總之,，以上結(jié)果表明間充質(zhì)干細胞參與小鼠半月板的成熟和再生過程,。

圖2 3D打印半月板支架結(jié)合自體滑膜移植促進半月板再生，在豬半月板次全切模型中保護軟骨免于退化

為驗證自體滑膜移植對半月板再生的影響,，本文使用小鼠半月板次全切（90%切除）模型,。首先，對內(nèi)側(cè)半月板進行次全切,。接著按解剖結(jié)構(gòu)植入3D打印的聚ε-己內(nèi)酯（PCL）半月板支架,，并用縫線固定殘余半月板組織，從髕上滑囊取自體滑膜組織,，并將其鋪在表面（圖2A3）,。最后對關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)進行復位。為追蹤半月板再生和軟骨狀況,，術(shù)后兩個月進行微創(chuàng)關(guān)節(jié)鏡檢查,。經(jīng)過綜合評估，關(guān)節(jié)腔內(nèi)未發(fā)現(xiàn)松動假體,，半月板支架完整而牢固的固定在其中,。整個半月板支架都被新形成血管豐富的組織覆蓋。為進一步評估新形成組織的含量和軟骨情況,，術(shù)后2個月研究人員進行取材,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)再生組織在形態(tài)和顏色上與原生半月板相似，且對脛骨軟骨覆蓋,、外周囊連接以及脛骨平臺的前后附著保持良好（圖2,，C1至C3）。脛骨內(nèi)側(cè)平臺和股骨內(nèi)側(cè)髁（MFC）只有輕微軟骨磨損,。髕股關(guān)節(jié)未發(fā)現(xiàn)軟骨退化情況,。內(nèi)側(cè)副韌帶附著點骨塊愈合良好。術(shù)后4個月,，再生組織與原生半月板相似度進一步提高,。脛骨內(nèi)側(cè)平臺存在適度軟骨磨損,。在MFC中僅觀察到輕度軟骨磨損。髕股關(guān)節(jié)軟骨狀況仍保持正常,。在假手術(shù)組中,，所有關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)均保持正常，表明手術(shù)未造成不良影響,。次全切組僅有部分軟組織附著在殘余半月板上,，軟骨退化明顯。在空白PCL支架組,，支架上可觀察到一些不規(guī)則軟組織存在,，軟骨發(fā)生侵蝕和缺損，內(nèi)側(cè)結(jié)外韌帶上端附著部位的骨塊愈合良好,。

圖3 3D打印半月板支架結(jié)合自體滑膜移植促進各向異性半月板再生

半月板由前至后分為三部分,，包括前角、體部和后角,。研究人員對每個部分的內(nèi)區(qū),、中區(qū)和外區(qū)進行分析（圖3A2）。在半月板次全切組中,，只觀察到一些疏松的纖維組織和纖維血管,，GAGs較少,。細胞主要由紡錘形的成纖維細胞組成,。空白PCL支架組中,，支架內(nèi)可觀察到一些纖維組織,、纖維血管和較少的纖維軟骨組織。新形成的組織與周圍半月板結(jié)合較差,。細胞成分中含有一些紡錘形的成纖維細胞和較少的橢圓形至圓形的軟骨細胞,。再生組織中可見血管。術(shù)后4個月時仍有PCL殘留,。PCL支架+滑膜移植組形成的纖維,、纖維血管較少，而纖維軟骨基質(zhì)較多,，具有不同數(shù)量的膠原和富含GAG的基質(zhì),。再生組織由紡錘形的纖維母細胞樣細胞和更多橢圓形至圓形的軟骨細胞樣細胞組成，再生組織中觀察到了血管,。接下來,，對再生組織中COL I和COL II的沉積情況進行分析，在PCL支架+滑膜移植組中,，再生組織中含有豐富的COL I和COL II,。COL II基質(zhì)主要分布在再生組織的內(nèi)區(qū)和中區(qū),，與原生半月板相似，表明COL II呈各向異性分布,。整個組織富含COL I,，但主要分布在中外層，與原生半月板相似,，表明 COL I呈各向異性分布,。用雙光子顯微鏡評估再生組織中膠原蛋白的含量。與半月板次全切組和空白PCL支架組相比,，PCL支架+滑膜移植組再生組織的膠原蛋白含量更高,，更接近于原生半月板的膠原蛋白含量。對原生半月板和再生組織的降低模量進行評估顯示,，半月板次全切組和空白PCL支架組的再生組織過于柔軟,，無法測量。PCL支架+滑膜移植組接近原生半月板的降低模量（35.25 ± 4.19 MPa）,。此外,，再生組織和原生半月板中均未出現(xiàn)COL10A1，表明半月板沒有肥厚,。血管造影顯示,，PCL支架+滑膜移植組的再生組織在術(shù)后2個月時血管豐富。術(shù)后4個月,，血管含量明顯減少,。PCL支架+滑膜移植組的軟骨磨損、蛋白多糖丟失較少,，骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織病理評估系統(tǒng)（OARSI）評分較低,，迷你豬在術(shù)后2個月和4個月內(nèi)恢復正常步態(tài)。

圖4 基質(zhì)硬度對YAP-pSmad2/3-SOX9軸的影響

與術(shù)后2個月相比,，PCL支架+滑膜移植組再生組織在術(shù)后4個月的機械性能明顯增加,。之前研究表明，基質(zhì)硬度是影響YAP激活的另一個關(guān)鍵因素,。研究人員假設(shè)基質(zhì)硬度會影響YAP-pSmad2/3-SOX9軸,。首先，為構(gòu)建不同基質(zhì)硬度條件,，將人SMSCs接種到柔軟的硅膠培養(yǎng)板或傳統(tǒng)硬質(zhì)聚苯乙烯培養(yǎng)板上,。在硬質(zhì)基質(zhì)條件下培養(yǎng)后，YAP-pSmad2/3-SOX9軸被激活,，YAP,、pSmad2/3和SOX9表達上調(diào)，pYAP表達下調(diào)。人SMSCs表現(xiàn)出纖維軟骨表型,，COL I,、COL II、凝集素和GAG表達上調(diào),。其次,，先前研究表明Piezo1能感知基質(zhì)的硬度。硬基質(zhì)處理后,，Piezo1的表達明顯上調(diào),，隨后下游鈣調(diào)蛋白、鈣調(diào)神經(jīng)蛋白和去磷酸化NFATc1的表達也上調(diào),。因此,，Piezo1可通過協(xié)同激活鈣調(diào)蛋白和NFATc1來感知基質(zhì)硬的程度，繼而激活YAP-pSmad2/3-SOX9軸,，促進人SMSCs生成纖維軟骨,。有綜述表明，硬基質(zhì)可通過整合素-FAK（局灶性粘附激酶）信號通路促進YAP的核轉(zhuǎn)位和活化,。本文研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)整合素-FAK信號通路被顯著激活,，整合素α5（ITGA5）、FAK和磷酸化FAK（pFAK）表達上調(diào),。磷酸化LATS1則明顯下調(diào),，導致YAP磷酸化減少。因此,，硬質(zhì)底物誘導的整合素-FAK信號激活抑制了Hippo信號轉(zhuǎn)導,，促進YAP的核轉(zhuǎn)位和激活。最后,，對PCL支架+滑膜移植組和原生豬半月板再生組織中FAK信號激活情況進行評估,。再生細胞和原生豬半月板纖維軟骨細胞FAK和pFAK表達明顯升高。術(shù)后4個月時,，再生細胞中FAK和pFAK的表達比術(shù)后2個月時有所增加。因此,，以上結(jié)果表明,，在半月板再生過程中，硬基質(zhì)通過激活Piezo1和FAK信號調(diào)控YAP-pSmad2/3-SOX9軸發(fā)揮作用,。

圖5 生物力學和基質(zhì)硬度通過Piezo1調(diào)節(jié)膠原交聯(lián)酶（LOX和LH）的表達

膠原纖維交聯(lián)程度是決定半月板機械性能的關(guān)鍵因素,，賴氨酰氧化酶（LOX）和賴氨酰羥化酶（LH）是使膠原交聯(lián)的主要酶。先前研究表明,，Piezo1導致原生肌腱組織中膠原交聯(lián)酶-LOX的上調(diào),。在此，研究人員假設(shè)Piezo1是半月板再生過程中膠原交聯(lián)酶的上游。如前所述,，在CTS或硬基質(zhì)處理后,，Piezo1在人SMSCs中上調(diào)。本文結(jié)果顯示人SMSCs經(jīng)CTS處理后,，LOX和LH2（LH家族成員之一）的表達顯著上調(diào),。LOX、LH1,、LH2和LH3的mRNA均上調(diào),。此外，Piezo1激動劑-YODA1處理后,，人SMSCs中LOX和LH的表達上調(diào),，而Piezo1拮抗劑-GsMTx-4處理后，LOX和LH的表達下調(diào),。因此,，硬基質(zhì)可上調(diào)人SMSCs中LOX和LH的表達。接著本文對PCL支架+滑膜移植組和原生豬半月板再生組織中LOX和LH2的表達進行了評估,。再生組織和原生豬半月板LOX和LH2表達均明顯升高,。因此，生物力學特性和硬基質(zhì)誘導Piezo1上調(diào)促進LOX和LH的表達,，從而在半月板再生過程中催化膠原交聯(lián),。

總結(jié)與展望
總之，本文利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型明確了間充質(zhì)干細胞參與半月板的成熟和再生過程,。在大型動物模型中,，3D打印PCL支架結(jié)合自體滑膜移植促進各向異性半月板樣組織再生，并保護軟骨免于退化,。從機制上講,，生物力學和基質(zhì)硬度上調(diào)間充質(zhì)干細胞中Piezo1的表達,，促進鈣離子內(nèi)流和鈣調(diào)素及NFATc1的協(xié)同激活，并進一步激活半月板再生過程中的YAP-pSmad2/3-SOX9軸。此外,，Piezo1可上調(diào)間充質(zhì)干細胞中LOX和LH的表達，從而催化膠原交聯(lián),，增強再生組織的力學性能,。因此，結(jié)合自體滑膜移植的3D打印生物仿真半月板支架將是一種有效的轉(zhuǎn)化策略,，可用于促進半月板再生,。值得在臨床上進一步研究。

文章來源：
https://www.science.org/doi/full ... Arid%3Acrossref.org