浙江大學(xué)團(tuán)隊(duì)《BDM》：光固化生物3D打印教程之高精度水凝膠支架制造

來源： EFL生物3D打印與生物制造

投影式光固化生物打印(Projection-based 3D  EFL生物3D打印與生物制造, PBP)具有精度高,、速度快、自支撐等優(yōu)勢,，近年來在生物制造領(lǐng)域有越來越多PBP的成功應(yīng)用案例,。然而，完全理解PBP的原理需要光學(xué),、高分子,、工程、生物學(xué)等綜合學(xué)科的背景知識(shí)，初學(xué)者熟練掌握PBP的流程也需要經(jīng)歷長時(shí)間的試錯(cuò)與經(jīng)驗(yàn)積累,。降低PBP的入門使用門檻,，可使更多研究者能從這項(xiàng)技術(shù)中受益。

近期,，EFL團(tuán)隊(duì)基于其多年相關(guān)經(jīng)驗(yàn),，在Bio-Design and Manufacturing雜志上發(fā)表題為“Projection-based 3D bioprinting for hydrogel scaffold manufacturing”Technical note，給出了一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的水凝膠支架打印流程,，我們將PBP生物支架打印分為了“材料配制”,、“支架打印”、“后處理”與“細(xì)胞接種”四個(gè)工序,，給出了標(biāo)準(zhǔn)化的操作方法,，整理了很多常見的問題、技巧及背后機(jī)制,。通過這篇教程,，希望能夠幫助PBP初學(xué)者，降低非工程學(xué)科背景使用者在工藝測試上的時(shí)間和成本,，將PBP作為得力工具加速其研究,。論文一作為孫元博士生，通訊作者為賀永教授,。

PBP工作流程

圖1 PBP操作流程圖（以EFL-8601打印機(jī)為例說明）

1. 材料配制：
介紹用于投影式光固化打印的GelMA光敏水凝膠的組成成分,、配比、配制方法,、儲(chǔ)存方法,、各成分打的功能機(jī)理。與常規(guī)三維細(xì)胞培養(yǎng)不同的是在材料中添加了可以降低打印誤差的吸光劑,。除標(biāo)準(zhǔn)化流程外,，特別強(qiáng)調(diào)了兩個(gè)實(shí)用的小技巧：先使用冷溶劑潤濕各成分后再加熱溶解，以及通過離心方法除去溶解后產(chǎn)生的大量微氣泡能夠顯著提升打印質(zhì)量,。

2. 支架打�,。�
因?yàn)橄嚓P(guān)打印設(shè)備的商業(yè)化，打印過程的設(shè)置已變得非常簡便,，而打印參數(shù)設(shè)置通常軟件里也配有推薦值,，初學(xué)者可根據(jù)軟件提示一鍵打印。然而作者重點(diǎn)提示了兩個(gè)打印過程中常見的問題：模型擺放方向與打印件脫落,，闡釋了打印時(shí)間,、x-y平面與z方向制造精度差異與模型擺放方向間的關(guān)系，介紹了采用打印原液對(duì)平臺(tái)涂底的防脫落實(shí)用技巧,。


3. 后處理：
后處理是很多熟悉PBP的研究者都容易忽略的過程,，科學(xué)的后處理不僅可以大大延長支架的儲(chǔ)存時(shí)間，而且能提升成品精細(xì)結(jié)構(gòu)精度與細(xì)胞粘附能力。后處理包括：清除剩余的未交聯(lián)材料,、消毒,、生物因子處理、凍干等標(biāo)準(zhǔn)步驟,。

4. 細(xì)胞接種：
與傳統(tǒng)培養(yǎng)皿或孔板中平面接種細(xì)胞不同,，PBP打印的水凝膠支架通常具有復(fù)雜的三維形貌，為復(fù)雜的曲面接種細(xì)胞通常需要多角度多次接種,。文中以空心管狀結(jié)構(gòu)為例,，介紹了如何將內(nèi)腔鋪滿細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化操作方法與其背后的原理。

實(shí)驗(yàn)案例

圖2 管狀支架應(yīng)用案例

管狀結(jié)構(gòu)廣泛存在于生物體內(nèi),，如血管,、髓鞘、膽管等,。作者按PBP標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行操作,，并給出了各環(huán)節(jié)的具體參數(shù)。通過PBP打印支架再接種的方法能夠制造出含有單層均勻布滿內(nèi)腔的內(nèi)皮細(xì)胞層血管模型,。

討論：載細(xì)胞打印 vs 支架接種細(xì)胞
如今載細(xì)胞打印技術(shù)也已非常成熟,，為什么我們還需要先制造支架再進(jìn)行接種的分步方案？作者給出了以下兩點(diǎn)重要理由：

1. 空間分離避免成形性與生物性的矛盾：
生物材料需要兼具生物性能與成形性能,，但這兩者通常是矛盾的,，優(yōu)異的生物性能需要多孔疏松的材料來降低對(duì)細(xì)胞的約束，提升物質(zhì)的交換,，這勢必會(huì)降低交聯(lián)過程中交聯(lián)基團(tuán)間發(fā)生反應(yīng)的概率,，降低成形性。這是細(xì)胞處于水凝膠內(nèi)部三維包裹時(shí)的情況,，即載細(xì)胞打印時(shí)無法避免的問題,。然而，支架打印剝離了制造與細(xì)胞培養(yǎng)的過程,，制造過程中無細(xì)胞，接種過程中細(xì)胞實(shí)際以二維鋪展?fàn)顟B(tài)粘附在三維支架表面,。兩個(gè)過程不再彼此制約,，從而可以制造出更加復(fù)雜的支架結(jié)構(gòu)用于搭載細(xì)胞。

2. 時(shí)間分離降低復(fù)雜度便于交叉合作：
載細(xì)胞打印時(shí),，必須同時(shí)滿足材料,、制造、細(xì)胞等前提條件,，受到細(xì)胞活性的限制,，整個(gè)過程必須在短時(shí)間內(nèi)完成。從研究者的實(shí)驗(yàn)角度考慮，這需要完整的材料,、工程,、生物因素同時(shí)在場，無疑在無形中大大提升了門檻,。而支架打印完全可以提前做好支架并凍干保存,，然后待細(xì)胞狀態(tài)合適時(shí)再進(jìn)行接種。這降低了完整流程的復(fù)雜度,、提升了成功率,、也方便不同學(xué)科間的交叉合作。

文章來源：
https://doi.org/10.1007/s42242-022-00189-0