四川大學(xué)的戎鑫團(tuán)隊(duì)：用于骨再生的 3D 打印多孔納米纖維支架

來源：EFL生物3D打印與生物制造

天然骨組織具有自我更新和修復(fù)的內(nèi)在能力,。然而,，由于創(chuàng)傷、腫瘤和感染等多種原因?qū)е碌拇笠?guī)模骨缺損的再生仍然是一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn),，因?yàn)閮?nèi)在的再生機(jī)制通常不足以恢復(fù)組織的完整性,。這一持續(xù)存在的臨床難題凸顯了創(chuàng)新方法的必要性。3D打印以其定制復(fù)雜幾何結(jié)構(gòu)的能力而聞名,，是組織再生的一個(gè)范式轉(zhuǎn)變,。它通過忠實(shí)復(fù)制大型復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，比傳統(tǒng)生物支架具有顯著優(yōu)勢(shì),。因此,，3D打印為減少傳統(tǒng)骨移植的風(fēng)險(xiǎn)提供了一條有希望的途徑，包括與組織來源,、免疫排斥和疾病傳播相關(guān)的問題。當(dāng)前3D打印技術(shù)在制造具有納米纖維結(jié)構(gòu)的分層3D支架方面存在顯著局限性,，這些支架旨在模擬天然骨細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）,，以增強(qiáng)骨再生。

來自四川大學(xué)的戎鑫團(tuán)隊(duì)提出了一種創(chuàng)新方法,，利用可生物降解的納米纖維微球作為生物墨水,，通過3D打印定制具有納米纖維結(jié)構(gòu)的分層多孔支架。體外研究表明,，分層多孔結(jié)構(gòu)顯著增強(qiáng)了細(xì)胞浸潤(rùn)和增殖速率,，而納米纖維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)提供了物理線索，引導(dǎo)成骨分化和ECM沉積,。當(dāng)作為細(xì)胞載體時(shí),，3D打印的納米纖維支架促進(jìn)了體內(nèi)骨組織的再生和整合。此外，簡(jiǎn)便且多功能的化學(xué)修飾有助于精確定制支架的功能,。使用具有高度仿生和多功能修飾特性的納米纖維微球作為這一通用3D打印方法的基礎(chǔ)成分,，使得從宏觀外部形態(tài)到分子級(jí)生化動(dòng)力學(xué)的支架生物學(xué)性質(zhì)得到了全面操控，從而滿足多樣化的臨床需求,。相關(guān)工作以題為“3D Printing Hierarchical Porous Nanofibrous Scaffold for Bone Regeneration”的文章發(fā)表在2024年11月16日的期刊《Small》,。   

【GelMA 納米纖維微球（GMNF-MS）的制備與表征】

GMNF-MS通過結(jié)合微流控技術(shù)和熱誘導(dǎo)相分離（TIPS）技術(shù)合成（圖1A）。在制備過程中,，GelMA溶液作為分散相,，而礦物油作為連續(xù)相，以生成球形的GelMA滴液,，隨后通過TIPS技術(shù)處理形成GMNF-MS,。這些GMNF-MS表現(xiàn)出狹窄的尺寸分布。通過調(diào)整連續(xù)相（GelMA溶液）和分散相（礦物油）之間的流速比,，可以定制GMNS-MS的尺寸（圖1B–F）,。在本研究中，使用了直徑為250 µm的微流控芯片,，并且GelMA溶液的流速為0.1 mL h−1,。當(dāng)?shù)V物油的流速從4降低到1 mL h−1時(shí)，GMNS-MS的直徑分別為55–58 µm和221–223 µm（圖1B–D）,。GMNS-MS的直徑符合線性方程Y = −2148.7X + 267.85,，其中X是GelMA溶液/礦物油的流速比（圖1F）。

圖1  GelMA納米纖維微球（GMNF-MS）制造示意圖

GMNF-MS的納米結(jié)構(gòu)和孔隙率通過改變GelMA濃度來調(diào)節(jié),。隨著GelMA濃度的增加,，觀察到納米纖維結(jié)構(gòu)和多孔特性逐漸減弱（圖2A–E）。當(dāng)GelMA濃度從8%增加到16%時(shí),，納米纖維的平均長(zhǎng)度從776 ± 175 nm減小到296 ± 71 nm,，同時(shí)納米纖維的直徑增加。值得注意的是,，在20%的GelMA濃度下,，納米纖維變粗并聚集（圖2D）。因此,，當(dāng)GelMA濃度從8%增加到24%時(shí),，GMNF-MS的孔隙率從96%降低到83%（圖2F）。與此同時(shí),，GMNF-MS的表觀密度和彈性模量分別增加了三倍和12.5倍（圖2G,H）,。此外，GMNF-MS的降解速率隨著GelMA濃度的增加而降低（圖2I）,。較高的GelMA濃度導(dǎo)致GMNF-MS的孔隙率和比表面積減少,，從而減少了明膠酶的攻擊點(diǎn)并減緩了降解速度,。不同濃度的GMNF-MS在30分鐘內(nèi)顯示出相似的平衡溶脹比，約為15倍,，表明GelMA濃度對(duì)溶脹平衡的影響最�,。▓D2J）。鑒于使用12% GelMA制備的GMNS-MS具有優(yōu)化的納米纖維結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì),，這些微球被選中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),。   

圖2 GMNF-MS的表征

【3D打印分層多孔GelMA納米纖維微球支架（HP-GNMS）和GelMA水凝膠支架（GHS）】   
為打印HP-GNMS，PF-127被用作支撐和犧牲墨水,，因?yàn)樗�具有�?yōu)異的流變性能,，可以在溫和條件下輕松打印并隨后去除（圖3A）。值得注意的是,，30%(w/v)的PF-127在22℃時(shí)表現(xiàn)出凝膠狀態(tài),，彈性模量約為0.84 × 104 Pa，而在4℃以下轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài),。這種相變簡(jiǎn)化了從3D打印的兩相支架中去除犧牲墨水的過程,。此外，在4℃下通過高速離心將微球摻入液體PF-127墨水中,，結(jié)果形成密集排列的微球以用于3D打�,。▓D3A）。密集排列的微球顯著改善了生物墨水的流變特性,。值得注意的是,，在22℃的打印溫度下，含有密集排列微球的生物墨水的彈性模量（2.5 × 104 Pa）明顯高于純PF-127（0.84 × 104 Pa）和在PF-127中均勻分散微球的生物墨水（1.7 × 104 Pa）,。此外,，在密集排列微球的條件下，由不同濃度GelMA（8%,，12%,，16%，20%和24%）制成的微球在22℃下的生物墨水彈性模量沒有顯著差異,。這表明微球的GelMA濃度對(duì)密集排列微球生物墨水的流變特性和可打印性影響不大,。

本文發(fā)現(xiàn)：在22℃下形成的Pluronic 127墨水，構(gòu)成了一個(gè)次級(jí)聚合物網(wǎng)絡(luò),，表現(xiàn)出強(qiáng)大的剪切變稀行為，確保在3D打印過程中高效擠出并迅速穩(wěn)定（圖3A）,。在整個(gè)打印過程中,，PF-127的獨(dú)特流變特性在保持密集排列微球的穩(wěn)定性方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用（圖3B,C）。此外,，PF-127的高粘度使得在氣動(dòng)擠出過程中堆疊的微球略微變形,，從而增加了界面接觸面積,，并在光交聯(lián)過程中促進(jìn)了HP-GNMS穩(wěn)定共價(jià)鍵的形成（圖3E–H）。交聯(lián)并去除PF-127后,，密集排列的微球保持了球形（圖3D）,。最終的HP-GNMS沒有明顯的塌陷或突出纖維的扭曲（圖3D,E）。如圖3G,H所示,，每個(gè)微球與相鄰的微球相互連接,，并在HP-GNMS內(nèi)部形成了交織的納米纖維網(wǎng)絡(luò)。機(jī)械分析顯示,，凍干的HP-GNMS的彈性模量為1.39 ± 0.19 MPa,，超過了大多數(shù)傳統(tǒng)水凝膠支架。雖然均勻分散微球的生物墨水也表現(xiàn)出優(yōu)異的可打印性,，但在UV交聯(lián)過程中微球之間缺乏緊密接觸阻礙了共價(jià)鍵的形成,，導(dǎo)致在去除PF-127后打印結(jié)構(gòu)發(fā)生塌陷。

圖3 分級(jí)多孔GelMA納米纖維微球支架（HP-GNMS）和GelMA水凝膠支架（GHS）的制備與表征

【BMSCs在HP-GNMS和GHS上的增殖與滲透】   

BMSCs被接種到HP-GNMS和GHS上,，以研究分層納米纖維結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞滲透和增殖的影響（圖4A）,。細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)揭示了不同的行為。具體來說,，GHS上的細(xì)胞在最初5天內(nèi)表現(xiàn)出初始的指數(shù)增長(zhǎng)階段,，隨后過渡到較慢的穩(wěn)態(tài)階段（圖3M）。相反,，HP-GNMS上的細(xì)胞經(jīng)歷了一個(gè)延長(zhǎng)且更陡的指數(shù)生長(zhǎng)期,，持續(xù)到第10天，然后進(jìn)入緩慢增長(zhǎng)階段,。這種差異至少歸因于HP-GNMS的兩個(gè)固有特征,。首先，相鄰微球之間的間隙形成了一個(gè)互聯(lián)的多孔網(wǎng)絡(luò),，為遷移和增殖提供了充足的空間,，并增強(qiáng)了氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散。其次,，納米纖維結(jié)構(gòu)提供了高表面積,，因此提供了足夠的粘附位點(diǎn)供細(xì)胞附著和增殖。因此,，BMSCs在HP-GNMS上的生長(zhǎng)比在GHS上更為旺盛,。

圖4 HP-GNMS和GHS上BMSCs的增殖與浸潤(rùn)

【HP-GNMS和GHS上BMSCs的成骨分化】

HP-GNMS組在成骨基因（包括SP7、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 (Runx2) 和骨鈣素（OCN））的表達(dá)水平上顯著高于GHS組,。在成骨（圖5E–G）和非成骨分化條件下,，均觀察到這種上調(diào)。ALP染色顯示,，HP-GNMS組的ALP表達(dá)明顯高于GHS組（圖5A,B）,。定量分析進(jìn)一步表明,，HP-GNMS在第3天、第7天和第14天的ALP活性分別是GHS的2.2倍,、3.5倍和4.2倍（圖5H）,。茜素紅染色顯示，HP-GNMS上有均勻的礦物沉積,，而GHS組只有少量的礦物沉積（圖5C,D）,。鈣沉積的定量評(píng)估顯示，HP-GNMS組在第7天,、第14天和第21天的鈣沉積量分別是GHS組的9.3倍,、16.6倍和19.0倍（圖5I）。Western blot顯示,，HP-GNMS組在14天的Col-1表達(dá)量是GHS組的3.4倍（圖5J,K）,。免疫熒光染色顯示，HP-GNMS表面（圖6A–C）,、間隙內(nèi)（圖6D）以及納米纖維微球內(nèi)部（圖6D,E）有均勻分布的膠原纖維,。相比之下，GHS表面上只有少量的Col-1沉積（圖6F–J）,。這些結(jié)果表明,，與GHS相比，HP-GNMS顯著增強(qiáng)了成骨分化和ECM沉積,。

   
圖5 成骨條件下HP-GNMS和GHS上BMSCs的成骨分化

圖6 HP-GNMS和GHS上BMSCs的Col-1分泌與沉積

【體內(nèi)骨再生】
將BMSCs負(fù)載的支架在體外培養(yǎng)3天后植入缺損部位,，可以深入了解HP-GNMS在等量外源性干細(xì)胞存在的情況下對(duì)骨生成再生的影響。這項(xiàng)研究策略還旨在探討在模擬等量?jī)?nèi)源性干細(xì)胞豐度條件下,，具有納米纖維結(jié)構(gòu)的分層多孔支架對(duì)骨生成再生的影響,。Micro-CT分析顯示，HP-GNMS組的新骨組織顯著覆蓋了缺損區(qū)域,，與空對(duì)照組和GHS組相比,，表現(xiàn)出顯著優(yōu)越的成骨能力（圖7A, B）。HP-GNMS組新骨體積分別是Empty組和GHS組的7.3倍和6.6倍（圖7E）,。值得注意的是,，在GHS組中，新形成的骨骼主要位于GHS的表面,，導(dǎo)致GHS內(nèi)部出現(xiàn)空洞（圖7B,，藍(lán)色箭頭）。盡管所有組的新骨密度相當(dāng)（圖7F）,，但天狼猩紅染色顯示,，HP-GNMS組的新骨成熟度更高，表現(xiàn)為亮橙色且更密集排列的膠原纖維（圖7D）,。此外,，牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（DMP1）的表達(dá)在HP-GNMS組中顯著升高，與Empty組和GHS組相比,，DMP1在調(diào)控成骨細(xì)胞分化和成熟,、骨細(xì)胞形成以及維持正常骨礦化方面至關(guān)重要，表明HP-GNMS組的骨形成和重塑得到增強(qiáng),。  

圖7 HP-GNMS和GHS作為BMSCs載體在8周后的體內(nèi)骨再生能力評(píng)估

【總結(jié)與展望】   
本文開發(fā)了一種結(jié)合微流控和TIPS技術(shù)的工藝,，用于制造均勻的GMNF-MS。這些GMNF-MS作為擠出式3D打印墨水的基礎(chǔ)構(gòu)建塊,，并用于制備HP-GNMS,。在墨水中添加PF 127后，能夠高效地將GMNF-MS通過3D打印制成HP-GNMS,。結(jié)果表明,，所得的HP-GNMS促進(jìn)了BMSC遷移和增殖。此外,，GMNF-MS的納米纖維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)提供了有助于引導(dǎo)成骨分化和ECM沉積的物理線索,。體內(nèi)研究證實(shí)，HP-GNMS顯著增強(qiáng)了骨組織再生和整合,，表明其優(yōu)于傳統(tǒng)的3D打印支架,。納米纖維微球的3D打印是開發(fā)生物啟發(fā)材料用于組織再生的新方法。

文章來源：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/smll.202405406