哈工大&港中文聯(lián)手登頂《Science子刊》|3D打印水凝膠立大功：藥物體內(nèi)輸送

來源： EngineeringForLife

細胞療法是指將細胞作為活體來替代受損組織,、調(diào)節(jié)生物功能和抗擊疾病,，近年來,，細胞療法作為一種前景廣闊的治療策略備受關(guān)注,。例如,，移植人類膽道上皮細胞可治療膽道疾病,，嵌合抗原受體 T 細胞療法可用于癌癥治療,，而干細胞療法有望在內(nèi)源性組織修復(fù)方面帶來益處。要充分發(fā)揮細胞療法的治療效果,，細胞的輸送途徑起著重要作用,，因為它們直接影響細胞的歸巢、存活和旁分泌功能,。全身給藥是應(yīng)用最廣泛的細胞給藥方法之一,，可根據(jù)血管途徑（即靜脈和動脈）進一步定義。然而,，由于移植細胞從血液到組織的遷移率較低,，在肝、肺,、脾中的滯留率較高,，因此其歸巢率和存活率并不令人滿意，細胞功能的維持也無法保證,。與全身給藥相比,，通過局部注射（如肌內(nèi)注射,、心內(nèi)注射和腹膜內(nèi)注射）或細胞負載支架植入手術(shù)進行局部給藥理論上具有較高的給藥效率，因而更具吸引力,。與嚴(yán)重依賴細胞向損傷組織遷移能力的局部注射相比,，細胞支架（CSs）移植的不確定性較小，但涉及的開放手術(shù)過程具有創(chuàng)傷性和臨床風(fēng)險,，可能給患者帶來痛苦和后遺癥,，并需要較長的恢復(fù)時間。當(dāng)前,，磁性微型機器人有望為基于細胞的微創(chuàng)療法帶來益處,。然而，它們通常在磁響應(yīng)性和生物醫(yī)學(xué)功能之間不可避免地存在權(quán)衡,。

來自哈爾濱工業(yè)大學(xué)（深圳）的金東東和來自香港中文大學(xué)的Kai Fung Chan和張立團隊合作報告了一種模塊化微機器人,，它由磁驅(qū)動（MA）模塊和細胞支架（CS）模塊組成。本研究利用3D打印技術(shù)制作了具有強磁性和 pH 響應(yīng)變形能力的 MA 模塊和具有細胞裝載-釋放功能的 CS 模塊,，隨后,，通過設(shè)計軸孔結(jié)構(gòu)和定制相對尺寸來組裝模塊，從而在復(fù)雜環(huán)境中實現(xiàn)磁輸送,，同時不降低細胞功能,。然后在目標(biāo)病灶處實現(xiàn)按需拆卸，以方便 CS 模塊的輸送和 MA 模塊的回收,。此外,，還在活體兔模型的膽管中驗證了所提系統(tǒng)的可行性。因此,，這項研究提出了一種基于模塊化設(shè)計的策略,，能夠無損地制造多功能微機器人，并促進其在未來細胞療法中的發(fā)展,。相關(guān)工作以題為“Modularized microrobot with lock-and-detachable modules for targeted cell delivery in bile duct”的文章發(fā)表在2023年12月15日的國際頂級期刊《Science Advances》,。

1. 創(chuàng)新型研究內(nèi)容
本研究開發(fā)了一種模塊化微機器人系統(tǒng)，該系統(tǒng)由專門的模塊（即 MA 模塊和 CS 模塊）組成,，旨在為靶向細胞遞送提供多功能特性,，并通過分工與合作解決不同功能之間的折衷問題（圖 1）。這兩個模塊都是通過3D打印技術(shù)定制和制造的,，并相應(yīng)設(shè)計了兩種水凝膠打印前體,，以滿足所需的功能，并實現(xiàn)分辨率約為 30 μm 的高精度制造,。具體而言,，MA 模塊通過引入豐富的釹鐵硼硬磁摻雜劑和懸垂羧基分子基團，分別具有強磁響應(yīng)性和 pH 觸發(fā)變形性,，而 CS 模塊則具有良好的生物相容性和生物降解性,，可用于細胞的裝載和釋放,。通過設(shè)計模塊的軸孔結(jié)構(gòu)、定制模塊的相對尺寸以及調(diào)節(jié)環(huán)境 pH 值,，MA 和 CS 模塊能夠以可控的方式組裝成多功能模塊化微機器人,。

本研究以膽管（BD）中的細胞輸送作為概念驗證，首先通過導(dǎo)管將獲得的微型機器人部署到目標(biāo)病灶附近,，然后在旋轉(zhuǎn)磁場的驅(qū)動下在狹窄曲折的管道中進行穩(wěn)健輸送,，這是傳統(tǒng)介入導(dǎo)管術(shù)難以達到的（第一階段）。模塊的穩(wěn)健組裝得到了全程保證,，以便通過 MA 模塊的螺旋推進,，在粘性和流動環(huán)境中順利運輸 CS 模塊。一旦微型機器人到達存在酸性環(huán)境的目標(biāo)部位,，其組裝狀態(tài)將通過 MA 模塊的 pH 響應(yīng)收縮解除鎖定,，然后額外引入低頻旋轉(zhuǎn)磁場，使可生物降解的 CS 模塊脫離,，以進行細胞治療（第 2 階段）。在最后階段,，分離的 MA 模塊被輸送回導(dǎo)管并進一步回收,，從而將潛在的安全風(fēng)險和長期副作用降至最低。在X射線透視或超聲（US）成像系統(tǒng)的實時引導(dǎo)下,，包括磁輸送,、按需拆卸和術(shù)后回收微型機器人在內(nèi)的整個過程在豬體外BD和兔體內(nèi)BD中得到了進一步的成功驗證。因此,，在模塊化設(shè)計原理的基礎(chǔ)上,，本研究提出了一種同時賦予微機器人卓越的MA能力和細胞功能而不損害它們的策略，這可能對未來開發(fā)基于細胞的無創(chuàng)靶向治療BD疾病大有裨益,。

圖1 用于 BD 靶向細胞輸送的模塊化微型機器人系統(tǒng)示意圖

【設(shè)計,、制造和鑒定專用模塊】

為了同時實現(xiàn)令人滿意的驅(qū)動和生物功能，本研究對模塊的組件和結(jié)構(gòu)進行了精心設(shè)計,。如前所述,，模塊化微機器人系統(tǒng)由兩個模塊組成（圖 2A），即具有主動移動性的軸狀 MA 模塊和具有生物相容性和生物降解性的孔狀 CS 模塊,，前者充當(dāng)發(fā)動機,，后者用于攜帶細胞。本研究利用基于投影微立體光刻技術(shù)的3D打印技術(shù)制造模塊,，這種技術(shù)使我們能夠以高分辨率定制復(fù)雜的亞毫米結(jié)構(gòu),。本研究開發(fā)了兩種水凝膠前體，即 pH 響應(yīng)磁性水凝膠前體和可生物降解水凝膠前體,，分別滿足 MA 和 CS 模塊的需求（圖 2B）,。pH 響應(yīng)磁性水凝膠前體由丙烯酸 (AAc),、甲基丙烯酸 (MAAc)、N-異丙基丙烯酰胺 (NIPAAM),、乙氧基化三羥甲基丙烷三丙烯酸酯 (TMP6EOTA),、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、苯基雙（2,4,6-三甲基苯甲�,；�）氧化�� (Irgacure 819) 和釹鐵硼微粒組成,。在印刷過程中，光引發(fā)劑 Irgacure 819 在紫外線照射下被激發(fā)產(chǎn)生自由基,，從而引發(fā)交聯(lián)劑 TMP6EOTA 和單體 AAc,、MAAc 以及 NIPAAM 之間的聚合反應(yīng)，進而構(gòu)成水凝膠框架,。由于從 AAc 和 MAAc 中引入了陰離子懸垂（羧基）基團,，制備的水凝膠具有 pH 響應(yīng)特性。當(dāng)環(huán)境的 pH 值高于它們的酸解離常數(shù)（pKa）時,，羧基就會電離,，相互之間產(chǎn)生靜電斥力，導(dǎo)致水凝膠發(fā)生膨脹行為,。本研究通過掃描電子顯微鏡（SEM）評估了 pH 響應(yīng)磁性水凝膠前體的 3D 打印性能,，如圖 2C 所示。圖 2C 可以清楚地觀察到制作的 MA 模塊的結(jié)構(gòu),，包括軸桿和螺紋,，這與設(shè)計的形態(tài)一致。這些結(jié)構(gòu)證明了 pH 響應(yīng)水凝膠前體 3D 打印的保真度和精度,，分辨率高達 30 μm,。

圖2 專用模塊的 3D 打印和表征

【利用專用模塊按需組裝和拆卸模塊化微型機器人】

在實現(xiàn)了不同專業(yè)功能模塊的制造之后，本研究關(guān)注了模塊的按需組裝和拆卸,。本研究設(shè)計了MA模塊和CS模塊相應(yīng)的軸狀和孔狀形狀,，將這兩個模塊整合為一個模塊化微機器人系統(tǒng)（圖3A）。細胞首先通過 GelMA 的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）基團與細胞上的整合素受體相互作用,，粘附并擴散到 CS 模塊上,，這在生物學(xué)上是穩(wěn)定和安全的。然后,，可定制孔形狀的 CS 模塊可與軸狀 MA 模塊機械固定,，形成模塊化微機器人。這種細胞裝載策略不僅有利于大量裝載細胞,，提高細胞治療的運輸效率,，還能最大限度地減少輸送細胞的意外損失。模塊化微機器人系統(tǒng)中模塊的組裝和拆卸都是可控的,。具體來說,，在3D打印后,，首先用酸性緩沖液處理 MA 模塊，使其體積收縮,，便于將其插入 CS 模塊的孔中,。在本研究中，CS 模塊的孔的內(nèi)徑固定為 850 μm（dc）,，而軸狀 MA 模塊的軸桿在中性環(huán)境下的尺寸從 650 μm 到 1150 μm（dm）不等,。因此，兩個模塊之間存在不同的干涉配合,，即 i = dm - dc（從 -200 μm 到 300 μm）,，可用于調(diào)節(jié) MA 和 CS 模塊之間的鎖定強度。如圖 3B 所示,，在依次將 MA 模塊收縮,、插入 CS 模塊并膨脹后，微機器人運動模式的改變,，包括前進,、后退、掉頭和滾動,，都會改變模塊化微機器人的裝配狀態(tài),，這取決于 i 的值，可以發(fā)現(xiàn) i 存在一個臨界值（即 160 μm,，圖 3B 中的紅色虛線），在此臨界值之上,，無論運動模式如何,，都能保證 MA 模塊和 CS 模塊之間的牢固鎖定（綠點區(qū)域）。相比之下,，當(dāng) i 小于 160 μm 時,，MA 模塊很容易與 CS 模塊分離（紅色交叉區(qū)域），尤其是在回轉(zhuǎn)和滾動運動中,，從而導(dǎo)致微機器人組裝失敗,。因此，這些結(jié)果為微型機器人模塊的尺寸設(shè)計提供了指導(dǎo),。在接下來的實驗中,，CS 模塊的內(nèi)徑和 MA 模塊的軸桿直徑（中性環(huán)境下）分別設(shè)計為 850 微米和 1050 微米，這使得模塊化微機器人的集成易于實現(xiàn),，并且在微機器人驅(qū)動過程中裝配穩(wěn)固,。在鎖定 MA 和 CS 模塊后，本研究關(guān)注了模塊化微機器人在不同旋轉(zhuǎn)頻率,、粘性環(huán)境和模擬 BD 內(nèi)生物條件的流動液體中的 MA 性能,。首先,，本研究在環(huán)境 pH 值為 7.0 的檸檬酸鈉緩沖液中研究了旋轉(zhuǎn)磁場頻率對微機器人運動性能的影響（圖 3C）。在 5 mT 的磁場強度下,，將旋轉(zhuǎn)頻率從 5 Hz 提高到 25 Hz 可加快微機器人的平均平移運動速度,，最大速度可達 6.5 mm/s。但值得注意的是,，將旋轉(zhuǎn)頻率進一步提高到 30 Hz 會使微機器人失去與旋轉(zhuǎn)磁場的同步性（即”跳出”現(xiàn)象）,，從而導(dǎo)致速度下降。

圖3 利用專用模塊對模塊化微型機器人進行穩(wěn)健組裝和可控拆卸

【在解剖 BD 模型中對模塊化微型機器人的定向輸送,、按需釋放和安全回收進行體外驗證】

為了驗證所開發(fā)的模塊化微型機器人系統(tǒng),，本研究首先在充滿無菌生理鹽水的模擬 BD 模型中評估了其驅(qū)動和運動性能（圖 4A）。模塊化微型機器人首先通過一根靈活的醫(yī)用導(dǎo)管（內(nèi)徑 2 毫米）注入 BD 模型,。在頻率為 13 Hz,、最大磁場強度為 27 mT 的外部旋轉(zhuǎn)磁場的驅(qū)動下，微機器人在模擬管道中表現(xiàn)出有效的螺旋運動,。通過精心控制旋轉(zhuǎn)球形磁鐵的位置和姿態(tài),，模塊化微機器人可以精確地輸送到 BD 模型的任意分支，包括肝 BD（左側(cè)和右側(cè)）和囊性 BD,。在初步進入膽囊管后,，微機器人被磁力引導(dǎo)回到分叉前的位置，隨后推進到其他分支,，分叉角度達到57.2°,，內(nèi)徑從2.8毫米縮小到1.7毫米。因此,，可以得出結(jié)論,，所開發(fā)的模塊化微型機器人系統(tǒng)能夠在復(fù)雜的模擬膽道中靈巧運動和選擇性輸送。接下來,，為了系統(tǒng)地研究模塊化微機器人系統(tǒng)的輸送能力,，本研究通過將位于最遠分支的左肝管定義為目標(biāo)病灶，演示了包括目標(biāo)輸送,、按需釋放 CS 模塊和精確回收 MA 模塊在內(nèi)的完整過程（圖 4A）,。如藍色區(qū)域所示，BD 模型中設(shè)計的靶點處的 pH 值設(shè)定為 5,。圖 4B（i 至 vi）展示了具有代表性的實驗結(jié)果,。模塊化微型機器人最初通過導(dǎo)管部署在管道的起點（i），然后根據(jù) MA 模塊對外部磁場的強磁響應(yīng),，在狹窄的管道中穿過三個分叉（ii）,。在通過一個 90° 拐角后，微機器人在 3 分鐘內(nèi)成功進入目標(biāo)分支（iii）。此時,，環(huán)境 pH 值變?yōu)?5,，促使 MA 模塊體積收縮，解除了模塊化微機器人的組裝狀態(tài),。同時施加頻率相對較低的 10 Hz,、強度為 27 mT 的磁場來驅(qū)動微機器人擺動，最終使 CS 模塊與微機器人分離（iv）,。這樣的拆卸過程成功地將裝載細胞的功能模塊送到了目標(biāo)位置,，用時約 10 秒，表明本研究的酸-磁刺激-組合分離策略是有效的,。最后,，將單個 MA 模塊移回初始部署位置并用導(dǎo)管收回，分別如圖 4B,、v 和 vi 所示,，這有助于將磁性材料的潛在副作用降至最低。

為了進一步揭示本研究提出的系統(tǒng)的優(yōu)勢,，本研究使用一個由非交互模塊組成的微機器人系統(tǒng)進行了對照實驗,。為此，本研究將干擾擬合值 i 設(shè)為 -110 μm,，這樣當(dāng) MA 模塊浸入中性緩沖液時,，就無法通過相互作用力將其鎖定在 CS 模塊內(nèi)部（圖 4C）。此時,，CS 模塊的運輸只能在向前運動時實現(xiàn),，因為向后運動會導(dǎo)致 CS 模塊掉落，這與上文提到的模塊化微機器人形成了鮮明對比,。圖 4D展示了兩種微機器人在 BD 模型中穿越分叉點時的代表性實驗結(jié)果,。結(jié)果表明，模塊化的微型機器人系統(tǒng)在進行后退運動以微調(diào)其位置后,，仍能保持裝配狀態(tài)并成功運送CS模塊，而沒有聯(lián)鎖連接的微型機器人則未能將貨物運送過分叉口,。本研究還進行了定量分析,，通過計算CS模塊進入四個預(yù)先設(shè)計的位置（包括部署位置和三個遠端分叉點）的比率來比較它們的運送效率。如圖 4E 所示,，所有模塊化微型機器人組都成功地將 CS 模塊送到了 BD 模型的指定位置,。相比之下，隨著微機器人依次通過分叉點,，對照組的進入率明顯下降（第一個和第二個分叉點的進入率分別為 50%和 25%）,，沒有一個 CS 模塊能被送到最遠的一個分叉點。因此，通過相互作用的 MA 和 CS 模塊之間的專業(yè)化和合作,，本研究的模塊化系統(tǒng)不僅能夠在曲折,、多分支和狹窄的管腔中進行穩(wěn)健的運動、有針對性的輸送和安全的回收,，還能防止藥物在輸送過程中過早丟失,。

圖4 在3D打印的 BD 模型中進行磁輸送、按需拆卸和回收微型機器人的體外演示

【模塊化微型機器人在醫(yī)學(xué)成像模式引導(dǎo)下在體外 BD 組織中的演示】

本研究對模塊化微型機器人系統(tǒng)在活體豬 BD 中的可行性進行了評估,。膽總管是連接十二指腸,、脾臟、膽囊和肝臟的重要通道,，因此被用作概念驗證,。當(dāng)膽管受到損傷時，一般會采用導(dǎo)管輔助介入療法,，通過細胞再生醫(yī)學(xué)來修復(fù)和愈合傷口,。然而，狹窄的通道和多個分叉嚴(yán)重限制了導(dǎo)管在遠端膽管的輸送和定向進入,，從而給有效,、安全的細胞治療帶來了顯著的挑戰(zhàn)。本研究開發(fā)了一種基于模塊化微型機器人的成像引導(dǎo)平臺,，以進入傳統(tǒng)技術(shù)難以到達的區(qū)域,，實現(xiàn) BD 內(nèi)的微創(chuàng)細胞輸送。如圖 5A所示,，除了活體豬 BD 被放置在一個人造模型內(nèi)以保持安全工作距離和防止意外碰撞外,，該平臺主要由三部分組成，即前面所述的模塊化微機器人系統(tǒng),、臨床成像設(shè)備（X 射線透視和 US 成像）以及將旋轉(zhuǎn)球形磁鐵集成在六軸機械臂上的磁力控制系統(tǒng),。為了觀察模塊化微機器人在組織內(nèi)的運動情況，本研究首先使用了診斷 BD 擴張的常用技術(shù) X 射線透視來實時監(jiān)測微機器人的狀況（圖 5B）,。管腔內(nèi)填充了造影劑（水合二苯甲酸鈉溶液）,，以便在 X 射線下對 BD 進行成像。從實驗透視圖像（圖 5C）中,，可以清晰地從周圍組織中分辨出 BD 的路徑和分支方向,，這將為微機器人系統(tǒng)的定向輸送提供全局環(huán)境信息。豬 BD 的內(nèi)徑從 2 毫米到 10 毫米不等,，存在一個角度約為 34°的分叉,。在本研究的實驗中，模塊化微型機器人首先在導(dǎo)管（i）的輔助下部署到普通 BD 中,。由于嵌入的釹鐵硼磁性顆粒具有不透射線的特性,，微機器人的 MA 模塊可以從背景對比中識別出來(ii)，從而實現(xiàn)在生物組織內(nèi)的 X 射線引導(dǎo)輸送。然后,，通過調(diào)節(jié)機械臂的位置和姿勢,，微機器人系統(tǒng)被磁力引導(dǎo)到以下分叉點，并推進到導(dǎo)管難以到達的肝管末端(iii),。微機器人在約10厘米長的距離內(nèi)航行大約需要1分鐘,，這表明模塊化微機器人的運動效率很高。此外,，通過磁力引導(dǎo)微機器人回到導(dǎo)管（iv）附近并隨后在 1 分鐘內(nèi)進入導(dǎo)管（v）,，也證明了可回收過程。這些結(jié)果驗證了利用所開發(fā)的微機器人平臺在 BD 真實管腔中對模塊化微機器人進行實時運動控制和跟蹤的可行性,。

圖5 在醫(yī)學(xué)成像模式的引導(dǎo)下,，在豬 BD 中對模塊化微型機器人的磁性運動和拆卸進行體內(nèi)外演示

【利用兔 BD 模型對模塊化微型機器人進行體內(nèi)驗證】

在豬 BD 體外的研究結(jié)果表明，本研究的模塊化微型機器人能夠通過磁場進行可控輸送和拆卸,，并且在 X 射線和 US 成像的實時跟蹤下清晰可見,。然而，這種評估方法并沒有充分考慮臨床經(jīng)驗,、結(jié)果和風(fēng)險,。為了進一步驗證本研究提出的系統(tǒng)在真實場景下的性能，本研究使用兔子模型進行了體內(nèi)動物試驗（圖 6A 和 B）,。實驗前,，通過 6 英尺導(dǎo)管注入造影劑，獲得了兔子 BD 的 X 射線圖像（圖 6C）,，從而可以詳細查看導(dǎo)管結(jié)構(gòu),。模塊化微型機器人的目標(biāo)位置選擇在總 BD 遠端，該處表現(xiàn)出循環(huán)蠕動并含有流動的膽汁,。往復(fù)運動周期約為 3 秒,，膽汁在總膽管中的平均流速約為 83 μl/min。在實驗過程中,，模塊化微型機器人通過導(dǎo)管（內(nèi)徑 1.8 毫米）部署在 BD 的入口處,，并通過磁力輸送到目標(biāo)位置，然后根據(jù)需要選擇性地釋放 CS 模塊,，最后收回 MA 模塊（圖 6C,，i 至 vi）。整個過程由 X 射線透視技術(shù)監(jiān)控,。與之前的體內(nèi)外實驗結(jié)果類似，盡管受到兔子身體的干擾,，但由于嵌入的磁性顆粒,，MA 模塊可以在 X 射線圖像中被識別出來。

圖6 X 射線成像引導(dǎo)下模塊化微機器人在兔 BD 中的體內(nèi)定向輸送

2. 總結(jié)與展望
為了解決磁性微型機器人在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的驅(qū)動和生物功能之間的折衷問題，受模塊化機器人技術(shù)的啟發(fā),，本研究設(shè)計了一種模塊化微型機器人系統(tǒng),，該系統(tǒng)具有異構(gòu)、專用和可鎖定拆卸的模塊,。該系統(tǒng)在以下方面顯示出巨大優(yōu)勢,。首先，得益于模塊化設(shè)計策略,，MA 模塊中的釹鐵硼磁粉含量可高達約 33 wt %,，從而在不影響其余 CS 模塊的細胞負載能力和生物降解性的情況下，獲得強磁特性,。其次,，模塊化微機器人裝配牢固，在粘度高達 12 cP,、平均流速為 5 cm/s 的流體中仍能發(fā)揮作用,，從而能在復(fù)雜多變的環(huán)境中進行有效的磁輸送輸送。第三,，所開發(fā)的拆卸策略可在進入目標(biāo)區(qū)域后的數(shù)十秒內(nèi)拆分模塊,，不僅可回收磁性部件，最大限度地降低對人體的潛在安全風(fēng)險,，還有利于縮短操作時間,，防止生物醫(yī)學(xué)部件過早脫落。最后,，模塊化微型機器人的輸送和拆卸過程與醫(yī)院現(xiàn)有的醫(yī)學(xué)成像模式兼容,，從而為未來的實際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

文章來源：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adj0883