微流控氣泡發(fā)生器與數(shù)字光處理平臺（DLP）用于3D多孔生物支架打印

來源： 生物打印與再生工程

3D打印多孔支架的多孔特性使支架具有增強(qiáng)細(xì)胞增殖,、擴(kuò)散,、遷移以及細(xì)胞分化能力的功能,，也提高了營養(yǎng)物質(zhì)的運輸或細(xì)胞代謝物的去除的效率,。但目前常用的犧牲微球法因為涉及溶解犧牲物的多個步驟,，具有耗時、靈活性差等問題,，也限制了孔尺寸的靈活可控性,。而微流控芯片能夠以更簡單、更快,、更可控的方式生產(chǎn)多孔結(jié)構(gòu),。基于以上原因,，越來越多的研究正在基于微流控原理開發(fā)生產(chǎn)多孔結(jié)構(gòu)的新技術(shù),。

近年來，已有學(xué)者將微流控芯片與擠出式打印機(jī)結(jié)合,，雖然該方法操作簡單,，但在制造具有復(fù)雜內(nèi)部架構(gòu)和外部形狀的體積結(jié)構(gòu)時，效率往往較低,。Yu Shrike Zhang教授團(tuán)隊選用基于閥門的流量聚焦（vFF）芯片和具有快速交聯(lián)的優(yōu)勢的3D數(shù)字光處理（DLP）打印平臺相結(jié)合,，從孔隙生成的大小、2D與3D打印的復(fù)雜度,，支架的生物相容性等方面證實了這項結(jié)合技術(shù)有望增強(qiáng)天然多孔組織的模仿特性,。

圖1 工作中使用的主要組件（A）VFF芯片（B）DLP平臺

一、表面活性劑的選擇
表面活性劑可以降低空氣-液體界面的表面張力,，防止氣泡破裂或合并,，確保一致的打印質(zhì)量和材料特性。因此,，該團(tuán)隊首先測試了三種表面活性劑（Rhamnolipids,、CTAB、Lecithin）對氣泡的穩(wěn)定性的影響,。結(jié)果表明在0.5%（w/v）和5%（w/v）的濃度下,，Rhamnolipids的泡沫穩(wěn)定性最差,。相比之下,，CTAB在5%（w/v）的濃度下比Lecithin的穩(wěn)定效果更好，但0.5%（w/v）的情況下相反,。由于Lecithin穩(wěn)定作用的濃度較低,，進(jìn)一步降低了其潛在的細(xì)胞毒性，且在5分鐘即大多數(shù)情況的足夠打印時間內(nèi)表現(xiàn)最好,，因此Lecithin被選為本實驗所用的表面活性劑,。該團(tuán)隊隨后進(jìn)行了濃度梯度實驗（0%,、0.5%、1%,、3%或5%（w/v）,，最終選用了1%濃度Lecithin作為最終的表面活性劑選擇。

二,、VFF芯片控制氣泡大小的參數(shù)設(shè)定探究
VFF芯片的結(jié)構(gòu)如下圖所示,，孔口寬度可以通過改變閥門驅(qū)動（valve channel actuation）的壓力大小來控制。在本研究中,，該團(tuán)隊通過改變以下三個要素：墨水流速（Flow rate）,，氣體通入壓力（Pg）和閥門驅(qū)動的壓力大小（Pv）探究了VFF芯片生成氣泡的大小范圍,。

圖2 VFF芯片的通道示意圖

首先,，該團(tuán)隊探究了閥門驅(qū)動的壓力大小（Pv）和孔口寬度之間的函數(shù)關(guān)系,。結(jié)果顯示兩者服從反S形函數(shù)關(guān)系,，在大氣壓力下，孔口寬度約為100μm,。在2.3bar的壓力下,，孔完全關(guān)閉并在>2.5bar的壓力下斷裂。

接著,，該團(tuán)隊控制Pv為大氣壓強(qiáng),，探究了墨水流速（Flow rate）和氣體通入壓力（Pg）對于氣泡生成的影響。結(jié)果表明氣體通入壓力以及墨水流速的不同組合可用于產(chǎn)生直徑均勻,、標(biāo)準(zhǔn)差小且尺寸可調(diào)的氣泡,，大小從211μm至747μm不等。

之后,，該團(tuán)隊改變閥門驅(qū)動的壓力大小Pv試圖進(jìn)一步縮小產(chǎn)生的氣泡的尺寸,，打破前述的平均約211μm的下限。結(jié)果顯示,，氣泡尺寸隨著壓力Pv的增加而減小,，呈非線性關(guān)系，氣泡最小縮小至143μm,。同時,，該團(tuán)隊還成功測試了三種參數(shù)的各種組合來證明不同條件下泡沫生成的穩(wěn)健性。

上述實驗結(jié)果證明在vFF芯片內(nèi)生成過程中氣泡的大小能夠得到控制,，不同工藝參數(shù)的變化范圍從143μm到747μm,。

圖3 VFF芯片中不同參數(shù)下孔徑狀態(tài)及氣泡大小

三、2D打印的可行性驗證
光引發(fā)劑可以引起化學(xué)交聯(lián)，是實現(xiàn)2D和3D打印性的重要試劑,。因此,，該團(tuán)隊對 LAP（phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphonate) 進(jìn)行了濃度梯度實驗（0.2%、0.4%,、1%（w/v）,，最終選用了1%濃度LAP用于進(jìn)一步實驗。在405納米光下曝光時間不到15秒即可實現(xiàn)堅固和可重復(fù)的交聯(lián),。

該團(tuán)隊對不同復(fù)雜程度的幾何形狀進(jìn)行了打印,，使用的是一套共同的工藝參數(shù)——油墨配方為7.5%（w/v）fGelMA，1%（w/v）卵磷脂,，1%（w/v）LAP,；flow rate=650μL min-1；pg = 1.3 bar,；pv =大氣壓力,。實驗結(jié)果證明工藝參數(shù)不需要根據(jù)幾何形狀進(jìn)行優(yōu)化，且印刷時間與結(jié)構(gòu)本身的復(fù)雜性無關(guān),。

之后,，該團(tuán)隊使用明場顯微鏡采集并展示了可以精確調(diào)整氣泡直徑的2D打印。通過使用50μL min-1的恒定體積流量,，變化區(qū)間為100至250mbar的Pg,，變化區(qū)間為0至2.25bar的pv，以2D打印了平均直徑為112 ± 7,、198 ± 7,、239 ± 19、361 ± 17和424 ± 17微米的氣泡并繪制了直方圖,。需要注意的是在這些實驗中使用vFF芯片產(chǎn)生的氣泡平均最大直徑可達(dá)424微米,，而vFF芯片內(nèi)最大的氣泡平均直徑可達(dá)747微米。該團(tuán)隊認(rèn)為可以歸因于芯片外部的氣泡不再被芯片的高度壓縮,，因此變成三維圓形,，減少直徑；此外,，較大的氣泡一旦處于芯片外的大氣壓力下,，往往會不太穩(wěn)定，這在一定程度上導(dǎo)致了氣泡的破裂,。

最后,，該團(tuán)隊測試了2D氣泡梯度打印的能力，以更好的實現(xiàn)在3D梯度打印的需求,。團(tuán)隊使用了直接適用于vFF芯片的快速數(shù)字控制,，因此可以連續(xù)不中斷的打印氣泡。大型氣泡是用50μL min-1的flow rate和pg = 250 mbar和pv =大氣壓力制備的,；中型氣泡的壓力降低到pg = 100 mbar,；小型氣泡壓力pv額外增加到2.25bar，以縮小vFF芯片的孔口,。在墨水交聯(lián)后,，團(tuán)隊觀察到高度均勻的圓形氣泡，其中大部分是六角填充對齊,。

綜上,，該團(tuán)隊研究結(jié)果證明，該設(shè)備可以在參數(shù)不變的情況下打印復(fù)雜幾何結(jié)構(gòu)并在其中生成大小可控的氣泡,。同時,，它具有梯度連續(xù)打印的能力。

圖4

四,、3D打印的可行性驗證
該團(tuán)隊通過使用自上而下的DLP打印機(jī),，進(jìn)行了復(fù)雜程度遞增的幾何形狀的3D打印。并且驗證了將打印結(jié)構(gòu)在細(xì)胞培養(yǎng)基中浸泡14天后其結(jié)構(gòu)完整性仍然能夠維持,，而不會出現(xiàn)明顯的變形,。同時，團(tuán)隊也指出了如空間分辨率較低和打印結(jié)構(gòu)表面不平整等一些缺陷,。

之后,，該團(tuán)隊使用共聚焦熒光顯微鏡與羅丹共軛fGelMA檢查了多孔結(jié)構(gòu)的空間結(jié)構(gòu)。分析顯示孔隙呈最密六邊形排列,，且大多數(shù)生成的孔隙已經(jīng)在3D排列中相互連接,。之后該團(tuán)隊對小、中,、大孔徑的樣本進(jìn)行了μCT重建,，這些結(jié)構(gòu)相比于共聚焦熒光顯微鏡的結(jié)果顯示孔隙度有所減少，該團(tuán)隊也給出了他們的猜想：一方面,，在3D打印時,，打印過程中表面張力和其他操作可能導(dǎo)致形成缺陷，導(dǎo)致泡沫墨水中的氣泡不完全緊密包裝,。另一方面,，在μCT掃描準(zhǔn)備樣品期間的處理可能導(dǎo)致結(jié)構(gòu)受到外部力量的影響。

綜上,，該團(tuán)隊證明,，盡管3D打印還存在一些缺陷，但生成的多孔結(jié)構(gòu)是精確可調(diào)節(jié)的,。3DDLP打印方法能夠生產(chǎn)具有良好均勻性,、范圍更廣泛可實現(xiàn)直徑以及更可控和更快的工藝的孔徑,。

表1 3D打印的最終參數(shù)匯總

圖5 驗證3D可打印性的打印結(jié)構(gòu)

五、細(xì)胞相容性的測試
當(dāng)涉及到組織工程和再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用時,，3D打印的多孔水凝膠結(jié)構(gòu)與種子細(xì)胞的細(xì)胞相容性對于組織替換至關(guān)重要,。在此基礎(chǔ)上，團(tuán)隊通過各種染色方法對細(xì)胞活力,、增殖,、遷移和傳播進(jìn)行了定性研究。

細(xì)胞首先在3D打印的多孔結(jié)構(gòu)中培養(yǎng)了14天,，并在1,、3、7,、10和14天進(jìn)行活/死檢測以及F-肌動蛋白/核染色,。在整個14天的栽培期中，團(tuán)隊觀察到死細(xì)胞的百分比都很低,，同時,，也在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞從聚集成簇變?yōu)閿U(kuò)散到占據(jù)支架的大部分。根據(jù)以上的實驗,，團(tuán)隊證明了支架具有良好的生物相容性,。

圖6 支架細(xì)胞相容性的實驗測試

總結(jié)
該實驗了將自上而下的DLP打印機(jī)與基于閥門的流量聚焦（vFF）芯片結(jié)合，建立了強(qiáng)大的打印流程,，并使用細(xì)胞染色分析進(jìn)行了細(xì)胞相容性測試,，結(jié)果表明，多孔結(jié)構(gòu)可以在14天內(nèi)支持細(xì)胞生長,、擴(kuò)散,、增殖和遷移。由于其物理化學(xué)特性,，fGelMA作為DLP打印的油墨材料受到青睞,。在材料選擇中，選擇了7.5%（w/v）的水溶液fGelMA溶液,，1%（w/v）的卵磷脂作為表面活性劑,，1%（w/v）的LAP濃度作為光引發(fā)劑。同時,，團(tuán)隊通過調(diào)整油墨流量和氣體壓力,、閥門大小，實現(xiàn)了對氣泡尺寸的控制,，當(dāng)前研究顯示的均勻直徑從大到747微米到小到143微米不等,。總體而言,，該實驗成功地在水凝膠基質(zhì)中生成了可調(diào)大小的均勻氣泡,，以制造細(xì)胞兼容的多孔支架,。

參考文獻(xiàn)
(Philipp Weber, Ling Cai et al. 2023)

Philipp Weber, Ling Cai, Francisco Javier Aguilar Rojas, Carlos Ezio Garciamendez-Mijares et al. Microfluidic bubble-generator enables digital light processing 3D printing of porous structures, Aggregate, 2023.

https://doi.org/10.1002/agt2.409