新型3D打印快速DNA分離微流控磁平臺(tái)

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生物樣品的純化或分離,，特別是作為生物信息存儲(chǔ)分子的脫氧核糖核酸(DNA),，是許多遺傳學(xué)研究,、法醫(yī)學(xué)、罕見(jiàn)病臨床診斷,、癌癥診斷和/或病毒疾病的關(guān)鍵和起點(diǎn),。到目前為止，許多不同的技術(shù),，如粒徑排除色譜法,、離子交換色譜法、親和色譜法,、堿性萃取法,、鹽析法、濾紙,、硅膠基質(zhì)(凝膠,、樹(shù)脂或微球),、磁性珠(市面上有填料柱、重力柱,、自旋柱,、自旋板和磁支架)等，都已被方便地用于分離DNA,。

相較于傳統(tǒng)的方法,，微流體系統(tǒng)提供小型化的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的應(yīng)用，允許在幾微米甚至納米的操作,，實(shí)現(xiàn)更好的準(zhǔn)確性,，減少分析時(shí)間，并提高整個(gè)隔離過(guò)程的可靠性,，同時(shí)最大限度地減少交叉污染的風(fēng)險(xiǎn),。在微尺度上精確控制流體的能力為用連續(xù)流動(dòng)過(guò)程和微流體系統(tǒng)中的各種功能組件(如通道、閥門(mén),、泵,、混合器和傳感器)取代批頂設(shè)備開(kāi)辟了許多可能性。

在這項(xiàng)研究中,，我們提出了一種新的磁性平臺(tái),，作為在螺旋微流控裝置中操縱超順磁珠快速分離DNA的創(chuàng)新解決方案。建立了一個(gè)計(jì)算模型來(lái)評(píng)估永磁體在平臺(tái)上的定位和旋轉(zhuǎn),。

研究?jī)?nèi)容
將超順磁性二氧化硅微顆粒(1mg)加載到基于pdm的微流控芯片中(圖1D),。將負(fù)載顆粒的微流控芯片放置在磁性平臺(tái)上(圖1A)。磁場(chǎng)是由微流控芯片下的磁體旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的,。注射器泵以所需的流速(5−20 μL/min)將緩沖液送入微流控裝置,。每次實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，用含有6 M Gu-HCl的結(jié)合介質(zhì)1 × TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA)緩沖液(pH 6.0)以20 μL/min的速度洗滌2 min,，制備分離體系,。DNA分離主要通過(guò)三個(gè)步驟進(jìn)行:(i)吸附，(ii)洗滌和(iii)洗脫,。

圖1  (A) CAD模型及3D打印平臺(tái),，(B)平臺(tái)的CAD分解圖，(C)用于PDMS成型的金屬模具,，(D)微流控芯片(硬幣直徑26.15 mm),。

在15,000、30,000和80,000倍的5,、2和1 μm bars的SEM圖像中,，磁性二氧化硅顆粒在形貌上分別為球形和單分散，約為6 μm(圖2B)。表面化學(xué)成分包含O,、Si和Fe原子,，其重量分別為51.03、33.02和15.95%(圖2B),。FTIR光譜顯示了磁性硅珠的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2C所示,。1060 cm−1處的峰代表結(jié)構(gòu)中的Si−O−Si鍵。630,570和440 cm−1處的吸收帶屬于鐵納米粒子(Fe−O拉伸),。6通過(guò)VSM分析獲得的磁滯曲線(圖2D)來(lái)評(píng)估顆粒的磁性,。磁滯曲線呈現(xiàn)超順磁特征，磁飽和度約為10 emu/g,。此外,，氧化鐵納米粒子(SPION)包覆的二氧化硅微粒子對(duì)矯頑力沒(méi)有永久磁化。

圖2  (A)合成磁性顆粒的形態(tài)結(jié)構(gòu)(SEM圖像),，(B)表面化學(xué)(EDX結(jié)果),，(C)化學(xué)結(jié)構(gòu)(FTIR光譜)，(D)磁性能(VSM結(jié)果),。

采用兩種不同類(lèi)型的DNA作為模型DNA:魚(yú)精子DNA和不同濃度的人胎盤(pán)DNA進(jìn)行微流控DNA分離。首先用魚(yú)精子DNA進(jìn)行分離,，每步的流速為10 μL/min,。分離在30分鐘內(nèi)完成(吸附10分鐘，洗滌8分鐘,，洗脫10分鐘,，更換注射器約1分鐘)。在pH為6.0的結(jié)合緩沖液中,，魚(yú)精子DNA被吸附到顆粒上,。如圖3A所示，魚(yú)精子DNA吸附量隨著DNA負(fù)載量的增加而增加,。在一定數(shù)量的DNA后,，吸附劑(磁性二氧化硅顆粒)達(dá)到飽和點(diǎn)，不再吸附吸附劑分子(DNA),，從而達(dá)到最大吸附容量(qm),。吸附效率曲線顯示，實(shí)驗(yàn)qm約為100 μg/mg顆粒(圖3A),。Sips吸附模型也被用于理解吸附過(guò)程的行為,。Sips模型對(duì)魚(yú)精子DNA吸附的回歸系數(shù)(R2)為0.990。模型的qm值為121 μg/mg,。吸附等溫線模型表明,，該體系可能以化學(xué)吸附為主，可以認(rèn)為是一個(gè)單層吸附過(guò)程。利用人胎盤(pán)DNA研究了在相同條件下(每步流速為10 μL/min,，結(jié)合緩沖液pH為6.0)系統(tǒng)的吸附行為,。選擇較高的濃度來(lái)確定不消耗DNA樣品的最大吸附量(圖3B)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)qm約為110 μg/mg,，這與文獻(xiàn)中幾種批處理系統(tǒng)中使用的磁性納米顆粒(16−121 μg/mg)相當(dāng),。Sips模型擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)，回歸系數(shù)為0.998,qm為109 μg/mg,，與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)吻合良好,。采用不同pH值的1 × TE緩沖液測(cè)定其解吸效率。以10 μL/min和100 μL洗脫量的魚(yú)精子DNA在室溫下重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次(圖3C),。

結(jié)果表明,，化學(xué)相互作用在解吸過(guò)程中也起主導(dǎo)作用。隨著洗脫緩沖液pH值從7.0增加到9.0,，解吸效率也從18%增加到38%,。

圖3  (A)魚(yú)精子DNA和(B)人胎盤(pán)DNA的吸附量。在每種流速下(樣品流速為10 μL/min),，三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值均為±標(biāo)準(zhǔn)誤差,。(C)不同ph值下魚(yú)精子DNA的解吸效率。每個(gè)pH值下3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)(樣品流速為10 μL/min),。

以魚(yú)精子DNA為模型DNA,，結(jié)合緩沖液pH為6.0，洗脫緩沖液pH為8.0,，研究了流速對(duì)分離步驟的影響,，比較了類(lèi)似材料和分離DNA所用的方法。為此,，分別以5,、10、20 μL/min的流速進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),。由圖4可知,，吸附效率與流速成反比，在10 μL/min的流速下,，吸附性能在70%左右達(dá)到飽和,。在達(dá)到飽和后，磁性顆粒不再具有結(jié)合額外DNA的能力,，這導(dǎo)致吸附效率達(dá)到平臺(tái)期,。隨著流速的降低，DNA緩沖液在微通道內(nèi)的停留時(shí)間會(huì)增加,，從而影響顆粒表面與DNA分子的接觸時(shí)間,，從而影響吸附動(dòng)力學(xué)和靜電相互作用，從而提高DNA吸附。此外,，微粒上的阻力也減小了,，這使得DNA分子更容易附著在微粒上。對(duì)解吸性能進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí),，可以明顯看出,，解吸效率隨著流量的增加而增加，當(dāng)流量為20 μL/min時(shí),，解吸效率可達(dá)75%左右,。這可以歸因于作用在DNA分子上的阻力的增強(qiáng)，這有助于從顆粒表面分離,。

在模擬中,，重離子垂直入射，MCD-FET和CAVET最敏感的位置都在p基右側(cè),，圖9中灰色箭頭所示,，p基附近存在高電場(chǎng)區(qū)�,？紤]到最壞的情況,，重離子會(huì)穿透整個(gè)裝置。圖4顯示了MCD-FET和CAVET在關(guān)斷狀態(tài)(VDS = 100 V, VGS = 0 V)下的IDS隨時(shí)間的變化,。MCD-FET和CAVET的IDS均上升到當(dāng)前峰值(Ipeak),，隨后逐漸降低。與CAVET相比,，MCD-FET表現(xiàn)出10.11 mA的低峰，降低了64.9%,。

圖4  不同流速下平臺(tái)對(duì)魚(yú)類(lèi)精子DNA的吸附,、解吸和分離效率。這些值是在每個(gè)流量下三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值,，±標(biāo)準(zhǔn)誤差,。

為了快速分離DNA，總操作時(shí)間必須保持在最低限度,。吸附效率在5 μL/min時(shí)最佳,，解吸效率在20 μL/min時(shí)最佳。10 μL/min時(shí)的吸附效率也接近5 μL/min時(shí)的吸附效率,。在較短處理時(shí)間的最佳操作條件下,，吸附步長(zhǎng)為10 μL/min，洗滌和解吸步長(zhǎng)為20 μL/min,，操作時(shí)間為10 min(吸附5 min,，洗滌2 min，洗脫3 min)，分離效率可達(dá)50%以上,。

表1給出了我們的平臺(tái)與文獻(xiàn)中可用的其他技術(shù)的不同方面的比較,。

表1  文獻(xiàn)中不同DNA分離方法的比較

雖然有比我們平臺(tái)的分離效率更高的方法，但考慮到樣品的數(shù)量,、裝載樣品的數(shù)量和處理時(shí)間,，我們的平臺(tái)具有更高的性能。但仍有改進(jìn)的空間,，特別是在解吸過(guò)程中,。在文獻(xiàn)中，有研究通過(guò)將洗脫緩沖液中的鹽量增加到1m,，并在高溫下使用磷酸鹽緩沖液來(lái)提高解吸效率,。因此，我們的平臺(tái)的解吸性能可以進(jìn)一步提高,，這將提高分離效率,。此外，我們的螺旋微通道內(nèi)有40 μL的體積,，這影響了加工時(shí)間,。微通道的體積、通道尺寸和流速可以進(jìn)行優(yōu)化,，以進(jìn)一步縮短處理時(shí)間,，從而確保快速隔離,。我們的平臺(tái)設(shè)計(jì)非常靈活,，實(shí)際上，微通道的幾何形狀可以根據(jù)要處理的樣品數(shù)量進(jìn)行優(yōu)化,。

總結(jié)與展望
在這項(xiàng)研究中,，提出了一種新型的小型化裝置作為3D打印的微流控磁平臺(tái)，用于快速分離DNA,。這種新穎的設(shè)計(jì)使磁性顆粒在螺旋微通道的限制下連續(xù)流動(dòng),。開(kāi)發(fā)了一個(gè)計(jì)算模型來(lái)評(píng)估磁操縱粒子的有效性。

內(nèi)部合成的超順磁單分散二氧化硅顆粒用于分離魚(yú)精子和胎盤(pán)DNA,。通過(guò)全面的實(shí)驗(yàn)評(píng)估了平臺(tái)的吸附,、解吸和隔離效率。我們的實(shí)驗(yàn)表明,，在我們的平臺(tái)上,，DNA分離可以在10分鐘內(nèi)完成。

最近,，我們的團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了柔性液壓儲(chǔ)層(FHR),，用于樣品加載到微流控芯片中,。帶有集成閥門(mén)的新版本FHR正在開(kāi)發(fā)中。隨著新版本FHR的實(shí)施,，在手術(shù)過(guò)程中不需要更換注射器,，這最終將使整個(gè)過(guò)程完全自動(dòng)化。此外,，我們的平臺(tái)具有靈活的設(shè)計(jì),，可以根據(jù)特定應(yīng)用修改FHR和微通道的體積。

因此,，考慮到樣品數(shù)量的靈活設(shè)計(jì),，快速分析，依賴于相對(duì)不太復(fù)雜的設(shè)備,，低成本制造,，以及最重要的是，具有便攜式護(hù)理點(diǎn)測(cè)試的潛力等優(yōu)秀特性,，我們的平臺(tái)是低成本,，快速DNA分離的可行選擇。進(jìn)一步提高分離效率和應(yīng)用我們的平臺(tái)分離不同的生物材料,，如細(xì)菌,、病毒、外泌體等,，將是我們未來(lái)的一些研究方向,。

論文信息：Gnes Kibar, Buigra Sartarslan, Serkan Doganay, Gokay Yildiz, O. Berk Usta, and Barbaros Cetin.
論文鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c04412