體內3D打印器官,！雙交聯(lián)工藝生物墨水法發(fā)了《Bioact. Mater.》

來源： EngineeringForLife

移植組織和器官短缺是臨床急需解決的問題。原位三維打印技術可直接在患者體內打印出新的組織或器官。但是這一過程中使用的打印墨水對結果至關重要，必須滿足特定要求，如快速凝膠化,、形狀完整、長期穩(wěn)定以及與周圍健康組織粘附特性,。在天然材料中,，蠶絲纖維素具有優(yōu)異特性，因此在組織工程和再生醫(yī)學中廣泛研究,。但蠶絲纖維素還需進一步改進,，才能滿足原位三維打印的要求。近日,，來自意大利特倫托大學的Antonella Motta教授團隊進行了使用雙交聯(lián)工藝絲素蛋白墨水進行原位3D打印的相關研究,。研究成果以“Silk fibroin-based inks for in situ 3D printing using a double crosslinking process”為題于01月25日發(fā)表在《Bioactive Materials》上。

本研究利用共價交聯(lián)工藝（包括打印前預光交聯(lián)和原位酶交聯(lián)）,，開發(fā)出可用于原位打印的蠶絲纖維素油墨,。對兩種不同分子量的蠶絲纖維素進行表征，共價鍵與剪切力協(xié)同效應增強蠶絲二級結構向β片層轉變,，實現(xiàn)快速穩(wěn)定,。新開發(fā)的絲素蛋白水凝膠具有良好的機械性能、長期穩(wěn)定性和耐酶降解性,，在14天內其二級結構和膨脹特性不會隨時間推移而發(fā)生顯著變化,。此外，體外實驗也證明其具有明顯的組織粘附性,。

本文從以下幾個方面進行詳細描述：
1. 蠶絲纖維素墨水的開發(fā)
2. 蠶絲纖維素墨水的表征
3. 體外生物評估

圖1 雙重交聯(lián)工藝設計與流程

使用擠壓式3D打印技術,，其墨水必須具有剪切稀化特性,、在擠壓過程中形成長絲以及合適的粘度。蠶絲纖維素不符合這些參數(shù),。設計的第一步就是克服粘度限制,。研究人員選擇兩種不同的蠶絲分子量：15 mB和30 mB，以及能形成共價鍵的交聯(lián)工藝,，以實現(xiàn)對結構,、降解和機械性能更多控制。設計了一種雙重交聯(lián)工藝,，由預凝膠階段和原位二次交聯(lián)組成,，前者是為使蠶絲纖維素可擠出，后者是為穩(wěn)定打印結構（圖1）,。打印噴嘴中擠壓應力誘導的物理交聯(lián)作用是使無規(guī)線圈快速過渡到β-片層結構,，從而進一步穩(wěn)定凝膠。打印出的凝膠形成機械穩(wěn)定系統(tǒng),，支持骨髓間充質干細胞粘附和存活，并在模擬組織上具有良好粘附性,。

圖2 可打印墨水粘彈性分析

由于預凝膠是通過光交聯(lián)實現(xiàn)的,，因此研究人員進行TNBS檢測研究與GMA的甲基丙烯酸化反應是否成功進行，從而量化甲基丙烯酸酯基團對伯胺的取代度（DS）,。結果發(fā)現(xiàn),，DS等于67%±3%。之后,，為進行預交聯(lián),，對甲基丙烯酸酯蠶絲纖維素（Sil-Ma）進行光交聯(lián)，從而形成不完全共價交聯(lián)凝膠（PC）,。酶促交聯(lián)（EC）取決于許多變量,，如溫度、自由基,、蠶絲濃度,、過氧化物濃度以及蠶絲分子量，因此在用作預交聯(lián)工藝時會出現(xiàn)差異,�,？紤]到蠶絲纖維素的氨基酸組成，酪氨酸約占總量的5%,，酪氨酸內鍵可形成高度穩(wěn)定,、富有彈性的水凝膠。為研究雙交聯(lián)（DC）方法是否可進行打印,，并驗證酶交聯(lián)（EC）是否會導致完全凝膠化,，進行流變學分析,。為評估可打印性，對不同成分進行粘彈性研究,。比較了雙交聯(lián)（DC）和光交聯(lián)前條件（PC）,，并添加完全光交聯(lián)凝膠（FC）和完全酶交聯(lián)凝膠（EC）作為對照。所有條件都具有粘彈性特性,，G′高于G'',。15mB預交聯(lián)產生可擠出的均勻長絲，而其他條件則會導致噴嘴堵塞,、異質凝膠化（如EC）和更高擠出壓力,。主要因為與15mB Sil-Ma相比，30mB Sil-Ma的分子量較低,。分子量越低,，鏈的纏結和長度就越少，從而影響動力學,。因此,，光交聯(lián)效率取決于蠶絲的分子量和濃度，與高分子量制備的Sil-Ma相比,，會產生較弱的凝膠,。不過，雖然在30mB分子量的情況下,，所有條件都出現(xiàn)一個流動點,，但擠壓EC和FC所需的高壓及其在重復試驗中的變化，使預交聯(lián)條件的選擇變得明確,、可重復,，并產生更均勻的絲線。

圖3 雙交聯(lián)工藝（DC）打印參數(shù)及結構分析

研究粘彈性特性后,，在LVE區(qū)域進行長時間流變測試,，結果表明，預交聯(lián)形成的預凝膠具有較低的儲存模量,。相比之下,，將這種預凝膠與HRP交聯(lián)（雙交聯(lián)DC）結合在一起會形成一種均勻的水凝膠，與前一種條件相比,，G'明顯更高,。在所有參數(shù)中，凝膠化主要受蠶絲分子量和濃度影響,。酶有一個初始延遲階段,，在這一階段檢測不到凝膠化，蛋白質仍然是液態(tài)的。然后,，酪氨酸鍵形成,，接著是鏈間蛋白質交聯(lián)。隨著時間推移,，這些動力學過程會導致進一步聚合,，直到酪氨酸鍵完全共價形成。雙交聯(lián)條件（DC）下的儲存模量在72小時內有所增加,。PC條件并沒有隨著時間的推移而出現(xiàn)顯著變化,，以上結果證實，預交聯(lián)不足以形成穩(wěn)定的均質凝膠,，而雙交聯(lián)則能形成適當?shù)哪�膠,。流變分析結果表明，全交聯(lián)凝膠（酶解交聯(lián),、光固化交聯(lián)和雙交聯(lián)凝膠）需要高壓才能擠出,，而且PC不足以形成穩(wěn)定的水凝膠，第二次原位酶解交聯(lián)是進一步誘導聚合物鏈之間共價凝膠化的必要步驟,。因此,，在進行三維打印時，先進行預光交聯(lián),，然后在原位激活酶交聯(lián),。

圖4 細胞在水凝膠中培養(yǎng)特性分析

圖5 使用25G噴嘴在皮膚表面進行雙交聯(lián)Sil-Ma原位打印

將骨髓間充質干細胞接種在樣品上后，對其代謝活性和細胞粘附性進行分析,。所有條件都支持細胞存活7天以上。在1-7天,，檢測到細胞代謝活性明顯增加,，不同測試條件和不同分子量之間沒有明顯差異。對細胞在基質上粘附情況進行分析顯示,。第 天,，細胞傾向于相互影響，形成細胞簇,，并出現(xiàn)一些突起,。培養(yǎng)7天后，細胞在所有條件下都呈現(xiàn)拉長,、伸展的形狀,。蠶絲纖維素的氨基酸組成以及地形、孔隙率,、刺激和硬度等因素對細胞在三維材料上的行為至關重要,。預交聯(lián)（PC）和雙交聯(lián)（DC）條件下細胞粘附力和細胞形狀沒有任何差異，表明細胞與材料相互作用的驅動力可能導致蛋白質重排。接著從體內應用角度出發(fā),，在皮膚表面進行雙交聯(lián)條件下的3D打印,，研究擠出墨水是否粘附在基底上。結果顯示Sil-Ma墨水附著在皮膚上倒轉基底時沒有發(fā)生脫落,。蠶絲纖維素因其氨基酸組成而具有粘合特性,，蠶絲氨酸極性側鏈通過形成氫鍵在與基質相互作用方面起關鍵作用。這些相互作用也可歸因于預交聯(lián)階段不完全凝膠化,，從而產生粘性預凝膠,，通過在原位完成凝膠化，使凝膠在組織內實現(xiàn)物理交聯(lián),�,？傊�，以上研究結果表明,，蠶絲纖維素可通過結合兩種不同交聯(lián)過程（包括光交聯(lián)和酶交聯(lián)）來滿足原位3D打印要求,。此外，3D打印后水凝膠表征為進一步優(yōu)化打印形狀以更好模擬組織復雜性提供有價值的數(shù)據(jù),。

總結與展望
本文開發(fā)了用于原位3D打印基于蠶絲纖維素的生物墨水,。該工藝的多功能性在兩種不同分子量蠶絲纖維素上得到驗證，通過調整制造工藝（即光照時間）,，原位3D打印得以實現(xiàn),。此外，研究人員開發(fā)了一種雙重交聯(lián)工藝,，通過不完全光交聯(lián)進行的預凝膠化與HRP驅動的原位凝膠化相結合,。使得水凝膠在介質和水中都能保持穩(wěn)定，在有X,、IV型蛋白酶存在的兩周內實現(xiàn)降解,。此外，噴嘴中擠壓應力誘導的物理交聯(lián)作用導致無規(guī)線圈向β片狀結構快速轉變,，從而在水和介質膨脹過程中提供穩(wěn)定性,。雖然PC和DC都是原位凝膠形成的良好候選材料，但它們之間的主要區(qū)別在于后者酶促共價交聯(lián)的協(xié)同效應,。一方面,，共價鍵不會影響蠶絲的二級結構，另一方面,，與預交聯(lián)水凝膠相比,，共價誘導的水凝膠在蛋白酶作用下更耐降解。表明蠶絲纖維素生物墨水特性可根據(jù)最終應用進行調整,。使用的墨水濃度都較低,，但通過共價交聯(lián)與物理交聯(lián)相結合，獲得的水凝膠在壓縮模量和膨脹性上都十分優(yōu)異。這簡化了制造過程,，避免蠶絲纖維素濃度調整等步驟,，從而提高凝膠結果的一致性。該生物墨水未來將進一步促進體內原位3D打印研究的進展,。

文章來源：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.01.015