擠出式生物3D打印構(gòu)建高度組織化結(jié)構(gòu)用于骨骼肌組織工程

來源： EFL生物3D打印與生物制造

3D生物打印是一項參與構(gòu)建組織工程材料的新興技術(shù),，目前已經(jīng)開發(fā)了不同的打印系統(tǒng),。其中,，基于擠壓的方法被證明最適合骨骼肌組織工程，因為它能夠以平行模式生產(chǎn)和沉積印刷纖維,，從而很好地模仿天然骨骼肌組織結(jié)構(gòu),。然而，此功能通常與細胞需求（例如細胞粘附和/或吸收性的動機）沒有很好的相關(guān)性,。

為了克服這一障礙,，來自羅馬大學(xué)生物系的C Gargioli聯(lián)合法國艾克斯-馬賽大學(xué)的S Testa團隊報告了一種新型基于擠出3D生物打印系統(tǒng)的開發(fā)和表征及其在小鼠模型中校正體積肌肉損失(VML)損傷的應(yīng)用。通過基于PEG-纖維蛋白原的使用獲得了高度組織化的3D結(jié)構(gòu),，其中小鼠肌肉祖細胞能夠分化成排列成對齊束的肌纖維,，并且能夠在體外培養(yǎng)時自發(fā)收縮（圖1）。

相關(guān)研究成果以“A novel extrusion-based 3D bioprinting system for skeletal muscle tissue engineering”為題于2023年2月3日發(fā)表在《Biofabrication》上,。

圖1 3D 生物打印和本體聚合過程的示意圖

1. 生物打印和散裝結(jié)構(gòu)中肌纖維成熟,、組織和同質(zhì)性的體外分析

印刷系統(tǒng)在維持細胞粘附、增殖和分化等生物過程中的有效性通過使用鼠類中成血管細胞(Mabs)進行評估,。單克隆抗體被添加到由PF組成的生物墨水中,，PF是一種結(jié)合了天然和合成益處的光固化水凝膠。將獲得的生物打印結(jié)構(gòu)在培養(yǎng)物中保存長達30天,，以獲得完全分化的肌纖維（圖2A）,。徑向位移表明在單個抽搐的收縮階段發(fā)生的位移，在生物打印條件下顯著更高（2.5倍）（圖2B）,。此外,，觀察到不同的抽搐方向性，平行于生物打印結(jié)構(gòu)中的打印軸,，而隨機定向在大塊結(jié)構(gòu)中（圖2B）,。

圖2 細胞化結(jié)構(gòu)中肌肉分化時程的明場成像

在第30天，在肌肉分化后,，針對肌肉分化標記物MyHC和結(jié)蛋白的整體免疫熒光分析對大塊和生物打印結(jié)構(gòu)進行了分析（圖3A）,。圖像分析證實，PF為Mab的維持提供了有利的微環(huán)境,，能夠在兩種條件下增殖和融合以產(chǎn)生大的多核肌纖維（圖3B）,。通過比較兩種條件下的肌纖維寬度、長度和連貫性,，評估了生物打印結(jié)構(gòu)中肌纖維尺寸更好組織和更大同質(zhì)性的證據(jù)（圖3C）,。與體積曲線相比,，生物打印結(jié)構(gòu)中的寬度分布似乎向更大的尺寸移動并且更尖銳（圖3C）。此外,，與大塊肌纖維相比,，生物打印結(jié)構(gòu)中的肌纖維平均長度明顯更高（兩倍），這一點也通過偏移長度分布得到證實（圖3D),。

圖3 散裝和 3D 生物打印結(jié)構(gòu)的免疫熒光分析

2. 構(gòu)造部分的分化和纖維排列分析
散裝和生物打印結(jié)構(gòu)都被快速冷凍以用于OCT鑄造以獲得冷凍切片,。免疫熒光分析證實在兩種情況下都存在結(jié)蛋白陽性和MyHC陽性肌纖維（圖4A)）。細胞能夠產(chǎn)生自己的細胞外基質(zhì)(ECM),，纖維周圍層粘連蛋白的存在證明了這一點,，表明細胞已經(jīng)成熟（圖4A）。

細胞密度是一種指示切片內(nèi)細胞存在和定位的測量值,，在生物打印結(jié)構(gòu)中顯著更高,，反映了肌纖維的更好分布，而在大塊結(jié)構(gòu)中,，細胞主要位于最外層（圖 4B）,。此外，在生物打印條件下,，在構(gòu)造部分上測量的圓度和橫截面積分別較高和較低,，表明肌纖維沿構(gòu)造縱軸的排列更好（圖4C）；另一方面,，大塊結(jié)構(gòu)顯示出更大的橫截面積但較低的圓度,，正如預(yù)期的那樣，肌纖維沒有定向在一個單一的方向上（圖4D）,。

圖4 結(jié)構(gòu)截面分析

3. 小鼠生物打印結(jié)構(gòu)植入后 TA 體積恢復(fù)
最后,，作者采用VML小鼠模型評估打印系統(tǒng)在再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的潛力。生物打印結(jié)構(gòu)被植入物在宿主肌肉內(nèi)整合30天,。在對照小鼠中,，TA 肌肉組織被消融，但沒有被人工構(gòu)造取代,。與對照相比,，植入的TA中的組織區(qū)域完全恢復(fù)，而對照則相反地顯示組織恢復(fù)不良和不足（圖5A）,。大量LacZ陽性細胞核被標記在重建組織的中央有核肌纖維內(nèi),，證明組織良好（圖5B）。

圖5 對消融和植入的小鼠TAs的免疫熒光分析

來自植入結(jié)構(gòu)的重建組織被證明具有適當?shù)难�管��,，如富含LacZ陽性細胞核的區(qū)域所突出顯示平滑肌肌動蛋白(SMA)和血管性血友病因子(vWF)的陽性信號，分別標記血管肌肉壁和內(nèi)皮細胞 (圖6A）,。此外,，呈現(xiàn) LacZ 陽性細胞核的重建肌纖維已被證明是受神經(jīng)支配的,，正如通過磷酸神經(jīng)絲 (pNF) 和α-金環(huán)蛇毒素 (BTX) 免疫染色對神經(jīng)突觸前和突觸后結(jié)構(gòu)的陽性標記所證明的那樣，證明在植入 3D 結(jié)構(gòu)后,，再生的TA肌肉內(nèi)神經(jīng)肌肉接頭的發(fā)展（圖6B）,。在nLacZMabs重建的TA區(qū)域觀察到Pax7陽性衛(wèi)星細胞，表明重建了肌肉再生所需的干細胞生態(tài)位（圖6C）,。

圖6 對3D生物打印結(jié)構(gòu)中nLacZ-Mabs再生區(qū)域的更高放大倍數(shù)分析

4. 人體生物打印結(jié)構(gòu)植入后TA體積恢復(fù)
為了評估將所提出的方法轉(zhuǎn)化為人類研究的可能性,，已經(jīng)進行了利用肌肉來源的載有hMSC 的生物打印結(jié)構(gòu)的試點實驗。與上述實驗類似,，在50% TA肌肉消融后,，將具有人類細胞的結(jié)構(gòu)植入小鼠后肢。外植 TA 的橫截面顯示兩個不同的區(qū)域,，一個是宿主的天然肌肉,，另一個是源自人類生物打印植入物的區(qū)域（圖7A）。盡管與鼠源性植入物相比,，異種移植物形成的組織總體上看起來組織性較,，但與許多人Lamin A/C (Lam A/C)陽性細胞核共定位的大 MyHC 陽性區(qū)域表明重建的肌肉組織來自人類，并且hMSC能夠生成與宿主消融TA整合的肌纖維（圖7B）,。

圖7 植入載有hMSC的生物打印結(jié)構(gòu)的小鼠TA橫截面的免疫熒光分析

對重建的TA組織進行更深入的分析顯示,，具有橫向小肌纖維的組織區(qū)域更多，這些區(qū)域在連續(xù)部分被證明是中央成核和 Lamin A/C陽性（圖8A）,。從人源性植入物重建的組織也顯示出適當?shù)难�管化和神�?jīng)支配,，正如血管（SMA和vWF）和神經(jīng)特異性（pNF和BTX）標記物所揭示的陽性信號所強調(diào)的那樣（圖 8B-C）。此外,，在一些纖維的外圍觀察到Pax7陽性衛(wèi)星細胞的存在,，從而表明重建的TA具有再生潛力（圖8D）。

圖8 對源自人類細胞的重建 TA 區(qū)域進行更高放大倍數(shù)分析

在這項工作中,，所提出的基于PF的無藻酸鹽擠出3D生物打印系統(tǒng)建立在僅使用PF作為構(gòu)成細胞支架的水凝膠的基礎(chǔ)上,，被證明是骨骼肌組織工程的一種新穎且具有競爭力的工具。所呈現(xiàn)的結(jié)果突出了這種創(chuàng)新印刷方法在兩個主要方面的潛力：一方面,，獲得體外生物替代品的可能性顯示出能夠自發(fā)收縮的適當組織的肌纖維,，這可以代表藥物篩選和肌病研究的生物平臺；另一方面,，印刷結(jié)構(gòu)在小鼠模型中恢復(fù) VML 損傷的功效,，包括小鼠和人源性肌源性祖細胞，表明所提出的方法可以代表再生醫(yī)學(xué)的顯著且有效的工具,。


文章來源：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/acb573