雙重交聯(lián)海藻酸鹽基熱響應(yīng)水凝膠作為3D打印生物墨水用于細(xì)胞球狀體生長(zhǎng)和釋放

來(lái)源： GK綠鑰生物科技

帕特雷大學(xué)化學(xué)工程系George Pasparakis教授團(tuán)隊(duì)在《Carbohydrate Polymers》期刊上發(fā)表文章“Dually crosslinked injectable alginate-based graft copolymer thermoresponsive hydrogels as 3D printing bioinks for cell spheroid growth and release”，作者研究團(tuán)隊(duì)在這項(xiàng)研究中開發(fā)了一種基于海藻酸鈉接枝共聚物的雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò),，具有聚(n-異丙基丙烯酰胺-co-n-叔丁基丙烯酰胺)P(NIPAM-co-NtBAM)側(cè)鏈，并對(duì)其作為一種剪切稀釋軟凝膠生物鏈接進(jìn)行了研究,。提出的生物墨水可以在溫和的3D打印條件下形成任意幾何形狀,。研究人員證明了所開發(fā)的生物墨水可以進(jìn)一步用作生物打印墨水，并展示了其促進(jìn)人類骨膜衍生細(xì)胞(hPDCs)在3D環(huán)境下生長(zhǎng)和形成3D球體的能力,。總之,，由于生物鏈接具有熱逆轉(zhuǎn)其聚合物網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)的能力,，因此可以進(jìn)一步用于細(xì)胞球體的快速恢復(fù)，這意味著它具有作為細(xì)胞球體形成模板的潛在用途,，可用于3D生物制造,。

WHAT—什么是雙重交聯(lián)注射型熱響應(yīng)水凝膠？

雙重交聯(lián)注射型熱響應(yīng)水凝膠是一種先進(jìn)的生物材料,，它結(jié)合了兩種交聯(lián)方式：物理交聯(lián)（如離子交聯(lián)）和化學(xué)交聯(lián)（如熱響應(yīng)性疏水相互作用）,，使其具備在特定溫度下可逆變化的特性。這種水凝膠設(shè)計(jì)為可注射,，能夠在體內(nèi)或體外通過(guò)改變溫度來(lái)調(diào)節(jié)其物理狀態(tài),，從而在3D生物打印、藥物遞送,、組織工程等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用潛力,。

WHY—為什么采用雙重交聯(lián)注射型熱響應(yīng)水凝膠作為3D打印生物墨水，用于細(xì)胞球狀體的生長(zhǎng)和釋放,？

雙重交聯(lián)機(jī)制提升了材料的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性,。注射型設(shè)計(jì)使其便于通過(guò)3D打印設(shè)備進(jìn)行精確成型。熱響應(yīng)性質(zhì)允許材料在溫度變化下發(fā)生相變,，有助于細(xì)胞球狀體的形成和釋放,。材料對(duì)細(xì)胞友好，支持細(xì)胞生長(zhǎng)和分化,。適宜的物理化學(xué)環(huán)境促進(jìn)細(xì)胞形成球狀體,。熱響應(yīng)性簡(jiǎn)化了細(xì)胞球狀體的回收過(guò)程
HOW—研究團(tuán)隊(duì)提出一種基于海藻酸鈉接枝共聚物的雙重交聯(lián)注射型熱響應(yīng)水凝膠,，作為3D打印生物墨水，用于細(xì)胞球狀體的生長(zhǎng)和釋放,。

在本研究中,，作者報(bào)道了一種基于海藻酸鈉的雙交聯(lián)聚合物凝膠劑，該凝膠劑由富含疏水性共聚單體N-叔丁基丙烯酰胺[NaALG-g-P（NIPAM-co-NtBAM）]的聚（N-異丙基丙烯酰胺）的熱響應(yīng)側(cè)鏈接枝,。當(dāng)加熱到臨界溫度以上時(shí),，P（NIPAM-co-NtBAM）側(cè)鏈的疏水結(jié)合誘導(dǎo)了第二次交聯(lián)，導(dǎo)致增強(qiáng)水凝膠（方案1）,。在加熱后,，海藻酸鹽側(cè)鏈的第一個(gè)離子交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)放大了雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的機(jī)械性能。

方案1 該示意圖顯示了用于形成和回收細(xì)胞球狀體的可注射雙交聯(lián)海藻酸鹽基水凝膠生物墨水及其在3D生物打印中的應(yīng)用

NaALG-g-P在不同濃度Ca2+的存在下研究了水性體系陽(yáng)離子,。特別是,，在冷熱循環(huán)之后，以1°C/min的斜坡速率,，頻率為6.28 rad/s,，在線性粘彈性狀態(tài)下進(jìn)行振蕩剪切實(shí)驗(yàn)，將應(yīng)變幅度保持在0.1%,。更詳細(xì)地了解Ca2+的影響圖1顯示了基于海藻酸鹽/PNIPAM的系統(tǒng)的流變行為,，所有六種配方的流變剪切振蕩數(shù)據(jù)。在圖1a的照片中可以看到三種f比不同的特征水凝膠的光學(xué)觀察,。

為了探究不同交聯(lián)模式之間是否存在相互作用,，過(guò)量的G′（ΔG′20–37）在20和37°C之間繪制在圖1f中，揭示了熱增稠效應(yīng)對(duì)網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)的貢獻(xiàn),。ΔG′線性增加,，二價(jià)陽(yáng)離子濃度在臨界f=0.03以下和以上不同，其中由于離子鍵合而出現(xiàn)彈性,。在f>0.03Δ時(shí),，G′隨f顯著升高，揭示了離子鍵合和疏水締合機(jī)制之間的協(xié)同作用,。

圖1 基于海藻酸鹽/PNIPAM的系統(tǒng)的流變行為

另一個(gè)可能影響接枝共聚物雙凝膠流變行為的可調(diào)因素是熱響應(yīng)貼紙的單體組成,。圖2比較了兩種海藻酸鈉/鈣凝膠劑在NtBAM含量上不同的熱響應(yīng)。疏水性NtBAM從6 mol%增強(qiáng)到14 mol%的主要作用是Tg的位移降低溫度約10°C,。低于Tg對(duì)于兩種凝膠劑,，兩個(gè)系統(tǒng)的儲(chǔ)存模量相等，前提是網(wǎng)絡(luò)是通過(guò)相同f的離子交聯(lián)形成的,。

圖2 兩種海藻酸鈉/鈣凝膠劑在NtBAM含量上不同的熱響應(yīng)

為了便于比較,，還研究了沒有附加離子交聯(lián)的體系凝膠形成。研究了無(wú)鈣體系的模量G′,、G′′隨角頻率（ω）的函數(shù),，并在20°C（即低于Tg）時(shí)表現(xiàn)出類似液體的行為其中既不存在疏水相互作用,，也不存在離子相互作用。在37°C時(shí),，NaALG-g-P（NIPAMx-co-NtBAMy）系統(tǒng)呈現(xiàn)較弱的凝膠狀形成,，這僅僅是由于基于PNIPAM的接枝鏈的疏水性，與NaALG-g-P（NIPAM相比）x-co-NtBAMy）/Ca2+其中兩種相互作用（疏水性和離子性）共存,，傳遞過(guò)大的交聯(lián)密度,。

圖3 NaALG-g-P(NIPAM86-co-NtBAM14)(不含Ca2+)水凝膠呈現(xiàn)溶膠-凝膠相變

在所研究的整個(gè)溫度范圍內(nèi)，離子交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的G′明顯更高,，在TTg處形成了更具彈性的水凝膠,。為了進(jìn)一步評(píng)估兩種交聯(lián)之間發(fā)生的協(xié)同效應(yīng),，NaALG/Ca2+的流變行為還探索了（無(wú)接枝鏈）基水凝膠，并在與接枝共聚物相同的F和聚合物濃度下進(jìn)行了比較,。這些結(jié)果證明了圖3b的數(shù)據(jù)所觀察到的協(xié)同效應(yīng)的合理性,。

圖4 NaALG-g-P(NIPAM86-co-NtBAM14)(不含Ca2+)水凝膠呈現(xiàn)溶膠-凝膠相變

聚合物基熱響應(yīng)水凝膠的一個(gè)重要方面是，在注射過(guò)程中剪切誘導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)破壞（原位凝膠化）后,，它在生理溫度下恢復(fù),。因此，水凝膠/Ca2+樣品在20°C（即在注射溫度下）進(jìn)行應(yīng)變掃描預(yù)處理,，遠(yuǎn)高于線性粘彈性狀態(tài)（應(yīng)變振幅γ=50，其中G′′>G′）,，緊接著在37°C下以0.1%的應(yīng)變振幅（在線粘彈性范圍內(nèi)）進(jìn)行時(shí)間掃描實(shí)驗(yàn),。圖4a演示了瞬時(shí)凝膠回收率,，前提是在溫度平衡至37°C后,，存儲(chǔ)模量以損失模量為主。圖4b顯示了不同剪切速率和溫度下的后續(xù)剪切粘度步驟,。
總之,，作者的目標(biāo)是在37°C下形成強(qiáng)凝膠作為仿生基質(zhì)，以宿主細(xì)胞并促進(jìn)球狀體的形成和生長(zhǎng),。理想的生物墨水應(yīng)構(gòu)成軟凝膠,，由于其輕微的粘性,，可以很容易地與細(xì)胞混合,，并在室溫下的打印過(guò)程中保護(hù)它們（圖5）。

圖5 5 wt% NaALG-g-P（NIPAM86-co-NtBAM14的粘度變化）含和不含Ca2+的水凝膠

作者還評(píng)估了水凝膠侵蝕,，因?yàn)樗�是生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的重要參數(shù),，包括受控藥物釋放分析,，侵蝕驅(qū)動(dòng)的擴(kuò)散率以及細(xì)胞封裝和釋放。如圖5c所示,，單交聯(lián)水凝膠的侵蝕速度明顯快于雙交聯(lián)水凝膠,。還研究了熱響應(yīng)性水凝膠的溶脹率（圖5d）。將凝膠浸入在37°C的PBS和PBS/Ca2+溶劑中,。在37°C下,，PBS中無(wú)鈣熱響應(yīng)材料的吸水率隨時(shí)間顯著增加，具有最高的溶脹能力（9000%）,。

圖6 生物材料油墨的擴(kuò)散比例

上述水凝膠再次3D打印,，首先在打印機(jī)的加熱床上，在37°C下,，在室溫下連續(xù)在床上，并評(píng)估生物材料油墨的擴(kuò)散比例,。鋪展比是通過(guò)將線寬除以針內(nèi)徑來(lái)定義的,，如圖6a。通過(guò)注射策略,，樣品在不同溫度下的粘性作為球狀體的潛在載貨具有重要作用,。粘度較低的凝膠在注射過(guò)程中需要較小的剪切應(yīng)力來(lái)轉(zhuǎn)移細(xì)胞，并且聚合物基質(zhì)在20或37°C下的獨(dú)特侵蝕曲線可能表明在以后的細(xì)胞/球狀體3D打印過(guò)程中具有不同的細(xì)胞球狀體釋放曲線,。
在本研究中,，離子和熱交聯(lián)機(jī)制的相互作用顯著增強(qiáng)了凝膠在非常溫和的條件下的功能和機(jī)械性能（彈性模量、抗侵蝕性和溶脹控制）,，而不會(huì)影響所得材料的可注射性/可印刷性,。

圖7 水凝膠中的細(xì)胞活力和生長(zhǎng)

最后，為了評(píng)估作者開發(fā)的水凝膠對(duì)細(xì)胞活力和細(xì)胞形成特性的影響,，作者進(jìn)行了一系列3D生物打印細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),。在圖7a中，來(lái)自光學(xué)顯微鏡的圖像顯示細(xì)胞在第1天均勻地分布在整個(gè)水凝膠中,，而在后來(lái)的時(shí)間點(diǎn)上觀察到3D球體的形成,。與細(xì)胞系不同，延長(zhǎng)至15天的培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)15天并未顯示出人類來(lái)源的單細(xì)胞形成的球狀體的進(jìn)一步生長(zhǎng),，細(xì)胞系HEK293T由于不受控制的細(xì)胞分裂（永生化細(xì)胞系）而具有相同的接種密度形成更大的球狀體,，因此作者在第7天結(jié)束了對(duì)球狀體的觀察。

根據(jù)這些觀察結(jié)果,，作者進(jìn)行了一系列檢測(cè),，以研究3D細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞活力和增殖。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在兩種生長(zhǎng)培養(yǎng)基中以不同的節(jié)律增殖,，通過(guò)對(duì)EdU染色表示（圖7b）,。第7天樣品的EdU染色所指示的增殖能力表明,，研究中使用的兩種培養(yǎng)基之間的增殖速率容量存在差異。

圖8 細(xì)胞培養(yǎng)基代謝物分析

為了進(jìn)一步證明該系統(tǒng)可以支持水凝膠內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng),，對(duì)葡萄糖,、乳酸和乳酸脫氫酶（LDH）等代謝物進(jìn)行了額外的代謝分析。從圖8a中可以看出,，葡萄糖消耗在所有鑒定的樣品中都發(fā)生了,，葡萄糖消耗量在相應(yīng)對(duì)照基線的不同時(shí)間點(diǎn)逐漸減少。

圖9 球狀體形態(tài)學(xué)分析

最后,，作者通過(guò)對(duì)DAPI染色對(duì)共聚焦顯微鏡獲得的圖像進(jìn)行球狀體形態(tài)學(xué)分析,，并在第3天采集phalloidin. 3D重建的圖像（圖9a），以檢查在兩種培養(yǎng)基中培養(yǎng)的水凝膠中球狀體的空間分布,。通過(guò)可視化F-肌動(dòng)蛋白,，作者旨在研究球狀體的邊界，同時(shí)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色,，為作者提供了有關(guān)球狀體細(xì)胞密度的信息,。作者比較了第3天與第7天球體的測(cè)量直徑，以證明球體形成動(dòng)力學(xué)（圖9c）,。雖然在這兩個(gè)組之間沒有發(fā)現(xiàn)每個(gè)球體中測(cè)量的細(xì)胞數(shù)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在差異（圖9e）,，但觀察到每個(gè)球體細(xì)胞數(shù)量的不均勻分布，這進(jìn)一步驗(yàn)證了這些細(xì)胞在3D培養(yǎng)環(huán)境中的特征異質(zhì)性,。作者還證明,，即使使用極低的起始細(xì)胞密度，hPDC細(xì)胞仍然具有形成球狀體的能力,，并且存活長(zhǎng)達(dá)7天,。

結(jié)論：本文重點(diǎn)介紹了基于海藻酸鈉接枝共聚物的雙交聯(lián)3D打印生物墨水的發(fā)展。海藻酸鹽骨架促進(jìn)了聚合物網(wǎng)絡(luò)內(nèi)原位球體的快速形成,，而可逆凝膠崩解使球體易于回收,，而不影響其活力和致密性,。最后,，發(fā)現(xiàn)溫和的雙交聯(lián)機(jī)制顯著放大了動(dòng)態(tài)機(jī)械性能，從而形成了適用于3D打印功能性活細(xì)胞群的穩(wěn)健聚合物網(wǎng)絡(luò),。作者提出的方法允許在溫和條件下開發(fā)具有自愈和剪切稀化特性的聚合物網(wǎng)絡(luò),，以便可以承載和促進(jìn)細(xì)胞球狀體形成，從而能夠在各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中利用這些生物材料作為細(xì)胞球狀體封裝劑用于藥物篩選,、微組織形成,、3D體外建模和可注射治療。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2023.120790