載有間充質(zhì)干細胞衍生外泌體的3D打印支架以改善血管生成和成骨

來源： EFL生物3D打印與生物制造

顱面骨再生是血管生成和成骨的耦合過程，與感染相關(guān)，在創(chuàng)傷或腫瘤切除后的骨缺損中仍然是一個挑戰(zhàn),。具有多功能治療特性的3D組織工程支架可以為受感染骨缺損的血管生成和成骨提供許多優(yōu)勢,。近日,，來自大連理工大學(xué)的宋克東研究員,、大連理工大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的姜大慶醫(yī)師聯(lián)合中科院過程所聶毅研究員團隊利用擠壓3D打印設(shè)計了一種富含微通道網(wǎng)絡(luò)的混合支架,，該支架由脫細胞細胞外基質(zhì)(dECM)、明膠(Gel),、季銨化殼聚糖(QCS)和納米羥基磷灰石(nHAp)(dGQH)組成（圖1）,。

相關(guān)研究成果以“3D bioprinting of dECM/Gel/QCS/nHAp hybrid scaffolds laden with mesenchymal stem cell-derived exosomes to improve angiogenesis and osteogenesis”為題于2023年2月9日發(fā)表在《Biofabrication》上。

圖1 dECM/Gel/QCS/nHAp@Exo混合支架的制造和機制示意圖

1. 生物墨水的合成和流變學(xué)特性
作者首先測試了dGQ 和 dGQH 生物墨水的流變行為以評估它們的可印刷性,。如圖2A-B所示,，dGQ 和 dGQH 生物墨水的復(fù)合粘度和儲能模量隨溫度降低而增加，結(jié)果表明所制備的生物墨水具有良好的溫度敏感性,。此外,，由于nHAp含量的增加，凝膠的相對濃度降低,，導(dǎo)致dGQH生物墨水的預(yù)凝膠溫度與dGQ生物墨水相比有所降低（圖2E）,。生物墨水的粘度隨著剪切速率的增加而降低，這是非牛頓流體和剪切稀化的典型行為,，特別適用于基于擠出的 3D 打印系統(tǒng)（圖2F）,。從流變學(xué)結(jié)果可以看出，生物墨水具有良好的印刷適性和穩(wěn)定的物理性能,，圖2I顯示了正在打印的支架以及凍干前后的生物打印支架,。

圖2 dGQ 和 dGQH 生物墨水的流變學(xué)特性

2. 支架的理化性質(zhì)
之后，作者首先對這些支架進行了拉伸和壓縮試驗,，以分析它們的機械性能,。由于支架的拉伸和壓縮應(yīng)力-應(yīng)變分別如圖3C-F所示，支架的拉伸模量和壓縮模量高于dGQ支架,。測試結(jié)果表明,，nHAp可以在一定范圍內(nèi)提高支架的機械強度，但如果nHAp含量過高,，支架會變脆,。作者還測試了支架的空隙率（圖3G）、蛋白吸附性（圖3H）以及支架的溫度穩(wěn)定性（圖3I）,。

圖3 支架的理化性質(zhì)

3. 支架的親水性,、降解性和血液相容性
接著，作者探究了支架的親水性,、降解性和血液相容性,。圖4A-B記錄了這些支架表面水接觸角在20 s內(nèi)的變化過程�,？梢灾庇^地發(fā)現(xiàn)支架的接觸角隨著nHAp的增加而增加,，表明nHAp可能會降低支架的親水性,。當(dāng)支架達到溶脹平衡時，dGQH支架的吸水率低于dGQ支架,，隨著nHAp含量的增加,，吸水率略有下降（圖4C-E）。

從圖4F的結(jié)果可以看出,，dGQ支架在2周內(nèi)降解了約80%,，到3周時幾乎完全降解，不利于新骨組織的形成,。而nHAp的加入有效地降低了支架的降解速率,，這可能是由于 nHAp 增加了酶反應(yīng)的空間位阻效應(yīng)。

此外,，溶血是評價生物材料生物相容性的重要指標(biāo),。在這里，支架的體外血液相容性通過溶血測定進行評估（圖4G）,。支架的溶血率隨著nHAp的添加而降低,。dGQH支架的所有溶血率均小于1%，遠低于dGQ支架（圖4H),。

圖4 支架的親水性和血液相容性

4. 支架的抗菌性能
用于顱骨傷口修復(fù)的支架的抗菌活性對于防止感染和加速缺損骨的再生是必要的,，因此作者對支架的抗菌能力進行了評估（圖5）。支架培養(yǎng)24小時的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的 CFU,，表明 dGQ 和 dGQH 支架具有顯著的抗菌活性（圖6A-B）,。隨著nHAp含量的增加，其抑菌活性減弱,，這可能是QCS相對濃度降低所致。在dGQH支架中,，dGQH20具有優(yōu)異的抗菌性能,，在骨組織工程中具有重要的應(yīng)用前景。

圖5 支架的抗菌性能

5. 支架的生物相容性和成骨特性
之后作者在含有不同量的 nHAP（0,、20%,、30% 和 40%）的支架上培養(yǎng)的hBMSCs 中評估細胞粘附、增殖和成骨蛋白表達（圖6）,。結(jié)果得出 nHAP 摻入模式和嵌入 nHAP 的濃度改變細胞活力和增殖的結(jié)論,。與不存在 nHAP 的情況相比，nHAP 導(dǎo)致細胞增殖顯著減少,；隨著支架中 nHAP 數(shù)量的增加,，細胞增殖減少（圖6A-B）。

支架的成骨特性通過特定成骨分化標(biāo)記蛋白（包括 ALP,、Runx2 和 Ocn）的表達進行評估,。dGQH20支架顯示出顯著上調(diào)的 ALP,、Runx2 和 Ocn 表達（圖6C）。這些發(fā)現(xiàn)表明dGQH20在所有成骨階段都有效地促進了hBMSC成骨分化,，與蛋白質(zhì)印跡數(shù)據(jù)一致,。為了確定 hBMSCs 在這些支架上的礦物質(zhì)沉積，在第 14 天進行了 ARS 染色和 V on Kossa 染色（圖6D）,。

圖6 支架的生物相容性和成骨特性

6. hADSCs-Exos 的體外生物學(xué)特性及其支架特性
為了評估dGQH20,、Exo和dGQH20@Exo支架的生物相容性，CCK-8測定表明Exo 組中的 hBMSC 增殖明顯高于對照組（圖7A）,。與所有其他組相比,，在具有獨特納米結(jié)構(gòu)的3D生物打印支架中培養(yǎng)并進一步增強了dGQH20@Exo組中 hBMSC 的增殖。在不同組中探討了對血管生成和成骨蛋白標(biāo)記物表達的影響,。在指定時間點收集人 BMSC 并進行蛋白質(zhì)印跡（圖7B）,。與沒有Exos的各自支架組相比，固定在dGQH20 支架上的Exos中 Runx2,、Ocn和VEGF的蛋白質(zhì)表達顯著更高,。

為了進一步評估促血管生成和促成骨作用，ARS,、ALP和V on Kossa染色用于觀察hBMSCs的成骨分化,，并測量了 HUVEC 在傷口愈合、遷移和管形成中的功能（圖7C-D）,。與 ALP 染色的趨勢相似,，ARS 和 V on Kossa 染色表明，與其他三組相比,，dGQH20@Exo 組顯著增加了hBMSC的礦化結(jié)節(jié)形成,；dGQH20@Exo組HUVECs的傷口愈合和遷移能力明顯強于其他組。

圖7 hADSCs-Exos 的體外生物學(xué)特性

7. 體內(nèi)骨再生和血管化評估
在證明了dGQH20@Exo支架的體外生物學(xué)效應(yīng)后,，之后確定了dGQH20@Exo支架對體內(nèi)成骨和血管生成的功效,。通過植入大鼠顱骨缺損模型 10 周，研究了支架的體內(nèi)骨再生能力,，并在小鼠皮下植入模型中評估了支架的體內(nèi)血管形成,。

為了觀察缺損區(qū)域的骨再生，將樣品切成切片并用 H&E,、Masson 的 T richome (MT),、ALP、Runx2,、Ocn,、CD31 和 VEGF 抗體染色（圖8A–C）。結(jié)果表明支架組ALP、Runx2和Ocn,、CD31和VEGF表達水平較高,；特別是對于 dGQH20@Exo組，成骨和血管生成蛋白表達水平被確定為最高,。

圖8 體內(nèi)骨再生和血管化評估

綜上,，本文制備了基于dECM的生物墨水，并通過擠出3D生物打印技術(shù)制造了dECM/Gel/QCS/nHAp 3D支架(dGQH),。對支架的形態(tài),、機械性能、孔隙率,、親水性,、生物降解性、抗菌能力,、血液相容性和生物相容性進行了表征和評估,。此外，dGQH20混合支架具有良好的抗菌活性以及出色的血液相容性和生物相容性,。受天然骨微結(jié)構(gòu)特征和血管化骨再生需求的啟發(fā),，基于靜電相互作用將血管生成因子和成骨因子（Exos）共同負載到dGQH20支架中。結(jié)果表明,，添加的 Exos 促進了細胞在支架上的附著和增殖,，并且在體外和體內(nèi) dGQH@Exo 支架中的成骨和血管再生也顯著增加。

文章來源：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/acb6b8