人工智能高通量篩選水凝膠均勻打印條件，加速糖尿病傷口愈合

來源： EFL生物3D打印與生物制造

糖尿�,。―iabetes mellitus, DM）在世界范圍內(nèi)為高發(fā)疾病, 其中我國患病人數(shù)最高, 在20~79歲人群中患者數(shù)量約1億人。而在糖尿病患者中, 約20%可出現(xiàn)傷口愈合困難,。若糖尿病患者傷口遷延不愈可導致糖尿病足或截肢，是造成糖尿病高致殘率的主要并發(fā)癥,，嚴重情況下可威脅患者生命。傷口愈合需要多種因素協(xié)同作用才能使其恢復屏障功能,。造成糖尿病傷口愈合困難的機制復雜,，包括氧化應激、長期慢性炎癥,、新生血管減少,、末梢神經(jīng)病變、細胞外基質(zhì)累積及重塑等,。

促進糖尿病患者傷口愈合仍然是臨床治療難點,。臨床目前主要的治療措施包括在控制血糖的基礎上預防傷口感染并促進傷口愈合。若出現(xiàn)感染,，主要處理措施為清創(chuàng),、敷料、全身使用抗生素等,。新研究的生長因子,、干細胞等療法，因有效性證據(jù)有限,、成本較高等原因?qū)е聭�用進展緩慢,。因此研發(fā)理想的傷口敷料仍然是促進糖尿病患者傷口愈合的重要突破口。

為此,，來自中山大學的周建華教授,、黃璐助理教授團隊，聯(lián)合哈佛大學醫(yī)學院的Yu Shrike Zhang（張宇）教授團隊研發(fā)了一種人工智能輔助的高通量印刷條件篩選系統(tǒng)（artificial intelligence-assisted high-throughput printing-condition-screening system, AI-HTPCSS）,，該系統(tǒng)以高通量方式篩選獲得均勻的水凝膠結(jié)構(gòu)的印刷條件,，通過優(yōu)化打印條件，打印的支架表現(xiàn)出優(yōu)秀的機械性能,、體外生物學性能,，體內(nèi)和體外實驗均表明其加速了糖尿病傷口的愈合。相關(guān)工作以題為“Artificial Intelligence-Assisted High-Throughput Screening of Printing Conditions of Hydrogel Architectures for Accelerated Diabetic Wound Healing”于2022年7月10日發(fā)表在《Advanced Functional Materials》雜志上,。

3D 生物打印是運用層積制造法,，借由3D生物打印機，制造利用生物墨水,，制造出支架,、仿生組織、和人類器官等,，在組織工程,、再生醫(yī)學和組織模型工程領域有極大應用。隨著生物材料墨水類型的快速增長和不同支架的復雜性,，傳統(tǒng)的印刷條件可能不再適用,。實際上,，最佳打印參數(shù)通常受多種因素影響，包括但不限于3D生物打印系統(tǒng)的品牌,、外部環(huán)境以及生物墨水的理化性質(zhì),。因此，開發(fā)快速篩選打印條件的有效策略,，以促進生物打印機和生物墨水匹配更佳的打印質(zhì)量,，是該領域的研究重點。

為解決該問題,，本研究提出了一種人工智能輔助的高通量印刷條件篩選系統(tǒng)（AI-HTPCSS）,。AI-HTPCSS由可編程氣動擠壓生物打印機和AI輔助圖像分析算法組成�,？删幊虤鈩訑D壓生物打印機的特點是改進的氣體驅(qū)動3D生物打印機和分級收集基板,。與具有水平表面的傳統(tǒng)基板相比，分級收集基板以0.57°的角度傾斜,，這使得打印距離參數(shù)可以通過簡單地沿著坡度方向移動打印頭來連續(xù)調(diào)整,，提供了更高的精度，減少了延遲時間,。借助可編程氣動擠出生物打印機,，可以以高通量的方式協(xié)同調(diào)整三個主要參數(shù)（打印壓力、噴嘴移動速度和打印距離）,，在參數(shù)不同組合下快速沉積生物油墨,。進一步通過AI輔助圖像分析算法對沉積在基板上的水凝膠圖像進行處理并輸出優(yōu)化的參數(shù)，為打印精確匹配相應數(shù)字設計的均勻水凝膠支架提供指導,。（圖1）

圖1 AI-HTPCSS用于加速糖尿病創(chuàng)面愈合的水凝膠結(jié)構(gòu)打印條件

1. AI-HTPCSS的構(gòu)建
AI-HTPCSS 由可編程氣動擠壓（生物）打印機和 AI 輔助圖像分析算法組成,。擠壓生物打印機是改進的氣體驅(qū)動 3D生物打印機（圖2A）和分級收集基板（圖2B），與具有水平表面的傳統(tǒng)構(gòu)建板相比,，獨特的漸變板是以 0.57° 的角度傾斜（圖2C）,，因此，打印距離參數(shù)（即噴嘴與基板表面之間的距離）可以簡單地通過沿著坡度方向移動打印頭穿過梯度板,，達到連續(xù)調(diào)整,。由于距離變化變得連續(xù)，因此該配置具有更高的精度,，同時減少了延遲時間,。

優(yōu)化后的打印頭用于氣動擠出生物材料墨水并將其沉積在構(gòu)建板上。施加到打印頭的移動速度和壓力由 Repetier-Host 軟件編程,。借助可編程的氣動擠壓生物打印機,，以高通量的方式協(xié)同調(diào)節(jié)三個主要參數(shù)（打印壓力、噴嘴移動速度和打印距離），并在不同的組合下快速沉積生物油墨,。

在高通量打印之后,，沉積在構(gòu)建板上的水凝膠圖案只需用手機從頂部拍攝即可。圖像經(jīng)過人工智能輔助圖像分析算法進一步處理（該算法經(jīng)過預訓練,，可自動識別和提取照片中的圖案信息）,。最后,，輸出優(yōu)化的參數(shù),，為打印與相應數(shù)字設計精確匹配的水凝膠支架提供指導。

圖2 AI-HTPCSS 的硬件配置

2. 使用 AI-HTPCSS 篩選印刷參數(shù)
在3D生物打印技術(shù)中,，零維(0D)的液滴和一維的線條是構(gòu)建復雜的二維平面或三維體積支架的組成部分,。因此，該研究從液滴和線條的圖案開始篩選,。在三個關(guān)鍵參數(shù)（即印刷壓力,、噴嘴移動速度和印刷距離）的不同組合下，擠出的藻酸鹽-明膠油墨的液滴和線條圖案如圖3A所示,。結(jié)果表明,，墨滴在長打印距離處形成，而線條通常在短打印距離處形成,。線形在低速（6-8 mm/s）下容易受到打印距離的影響,，但在采用10 mm/s的高速時影響較小。

為了進一步分析印刷參數(shù)對藻酸鹽-明膠油墨擠出圖案的精確影響,，本研究開發(fā)了一種新型的人工智能輔助圖像分析算法,。首先，如圖 3B所示,，將包含不同圖案的擠出水凝膠的圖像劃分為94個子區(qū)域（每個子區(qū)域50 × 50像素,，每個子區(qū)域 10 mm × 10 mm），以獲得不同圖案的小圖像,。然后,，使用經(jīng)過訓練的機器學習網(wǎng)絡，準確識別每個子區(qū)域中的模式狀態(tài),。根據(jù)識別結(jié)果,，總結(jié)了模式狀態(tài)的相圖（圖3C）。

通過逐行掃描方法對不同條件下打印的線條寬度進行量化（圖3D（i））,。計算預期水凝膠線區(qū)域內(nèi)的像素數(shù),，然后根據(jù)縮放器將其轉(zhuǎn)換為寬度值。通過這種方式,，以高通量的方式獲得了不同打印參數(shù)下的線寬,，在圖 3D(ii)中顯示為相圖。此外，繪制了顯示線寬分布的曲線,，并通過計算變異系數(shù) (CV) 來確定線的均勻性,，如圖3E(i, ii)所示。結(jié)果表明,，當印刷壓力保持在30-40 psi且噴嘴移動速度保持在8-10 mm/s時,，可以獲得高度均勻的線條。最后,，如圖 3E(iii)所示,，得出了顯示不同打印參數(shù)下線條均勻度程度的相圖。

圖3 使用 AI-HTPCSS 篩選打印參數(shù)

3. 在優(yōu)化條件下打印 3D 水凝膠支架
基于上面篩選出的打印高保真線的最佳參數(shù)（圖4A）,，打印了用于傷口敷料的多層水凝膠支架,。結(jié)果顯示，優(yōu)化的印刷條件下可以獲得更高的均勻性,，不同線距或圖案的支架表現(xiàn)出不同的機械性能,。評估了印刷水凝膠支架的壓縮模量及其機械穩(wěn)定性。

用含有2.5 wt.%的海藻酸鈉和8.0 wt.%的明膠的水凝膠溶液打印具有不同孔隙率的支架,具有不同孔隙率的支架表現(xiàn)出不同的機械性能,。如圖4B所示,，每個支架都被一對鑷子夾住，以證明明顯的轉(zhuǎn)移,。結(jié)果發(fā)現(xiàn),，印刷的不均勻水凝膠支架由于其不均勻的機械強度而未能保持原始的片狀結(jié)構(gòu)。為了進一步驗證支架的機械性能,，分別對間距為 0,、0.8、1.0 和 1.2 mm 的水凝膠支架和蜘蛛網(wǎng)形狀的支架進行了計算模擬（圖4C））,。結(jié)果表明,，不同線距或圖案的支架表現(xiàn)出不同的機械性能。不均勻支架組位移最大,，與實驗結(jié)果一致,。

隨后進行了拉伸試驗，并確定了支架的彈性模量（圖4D,，E）,。如圖4E所示，間距為0,、0.8,、1.0、1.2mm的腳手架,、蜘蛛網(wǎng)狀腳手架和不平整腳手架的彈性模量分別為0.639,、0.278,、0.266、0.241,、0.461和 0.043 MPa,。根據(jù)之前的發(fā)現(xiàn)，除了不均勻的水凝膠支架外,，所有的水凝膠支架都具有與皮膚的彈性模量相匹配的彈性模量,，以確保它們是治療皮膚傷口的合適候選者。最后評估了印刷水凝膠支架的壓縮模量及其機械穩(wěn)定性（圖4F）,。測試在新打印的支架和打印后儲存7天的支架上進行,，結(jié)果表明，線間距為0mm和0.8 mm的支架比不平整結(jié)構(gòu)組和間距為1.0和1.2 mm的支架具有更高的抗壓模量,。

這些結(jié)果共同表明,，在優(yōu)化條件下打印的水凝膠支架表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性,。

圖4 在優(yōu)化的打印條件和未優(yōu)化的打印條件下制造多層水凝膠支架

4. 水凝膠支架的體內(nèi)外療效評價
為了評估打印的水凝膠支架的細胞相容性,，使用CCK-8測定法和免疫熒光法，測定與水凝膠浸泡的培養(yǎng)基一起孵育的人表皮角質(zhì)形成細胞 (HaCaT) 細胞的活力,。發(fā)現(xiàn)暴露于不同濃度的水凝膠浸泡介質(zhì)的HaCaT細胞在 24 小時顯示>90%的高存活率（圖5A,、B）。上述結(jié)果表明水凝膠的成分對細胞可能無害,。

為了進一步評估印刷水凝膠支架上細胞的增殖,，使用 CCK-8 測定法確定了與支架一起孵育的NIH/3T3成纖維細胞的活力（圖 5C）。發(fā)現(xiàn)暴露于支架的成纖維細胞在第3天和第5天（與第1天相比）顯示 > 100% 的相對活力,，表明支架可以有效地支持細胞增殖,。

此外，使用體外劃痕試驗研究了印刷水凝膠支架上的細胞遷移行為（圖5E,、F）,。結(jié)果表明，劃痕在細胞遷移的作用下逐漸閉合,。

圖5 打印的水凝膠支架的體外細胞評估

為了評估印刷水凝膠支架對糖尿病傷口愈合的治療性能,，進行了體內(nèi)實驗。在每只糖尿病大鼠的背部打一個全層皮膚缺損處,，然后用印有不同結(jié)構(gòu)的水凝膠支架覆蓋,，記錄不同敷料的傷口閉合過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn),，水凝膠支架覆蓋的傷口比對照組的傷口愈合率更高,，未進行任何治療的對照組在第7天和第14天均表現(xiàn)出更高水平的炎癥（圖6）。

圖6 印刷水凝膠支架在大鼠糖尿病傷口愈合中的應用

在這項工作中,，成功建立了一種新型 AI-HTPCSS,，用于快速篩選 3D 擠出生物打印機和生物材料墨水的給定組合的 3D生物打印參數(shù)。基于AI-HTPCSS,，可以很容易地獲得用于擠出高保真水凝膠長絲的優(yōu)化打印參數(shù)（例如,，打印壓力、移動速度和打印距離）,，而傳統(tǒng)的打印條件優(yōu)化策略難以實現(xiàn),。在篩選出的優(yōu)化條件的基礎上，將具有不同結(jié)構(gòu)的多層網(wǎng)格圖案水凝膠支架打印為糖尿病傷口敷料,。體外和體內(nèi)實驗進一步表明,，線距為0.8 mm的支架和蜘蛛網(wǎng)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出更好的生物學性能，可有效加速糖尿病傷口的愈合,。上述結(jié)果驗證了該方法在篩選生物打印條件方面的可行性,，表明其在指導制造3D生物打印組織工程支架和可能含有細胞的組織結(jié)構(gòu)方面的潛在價值。最后,，AI-HTPCSS 有望為（生物）制造過程提供有用的指導,，并加速將3D生物打印技術(shù)用于擴展到生物醫(yī)學應用。

文章來源：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202201843