視力損傷有救了,，這篇《Biofabrication》關(guān)注“角膜”生物打印

來(lái)源： EngineeringForLife

角膜是一種透明、無(wú)血管的組織,，作為眼睛的前窗,，對(duì)視力至關(guān)重要。角膜厚度的90%由高度有序的基質(zhì)層組成,，其中央厚度為470–500微米,。基質(zhì)層中的膠原纖維有兩個(gè)顯著特征：纖維較窄且具有物種特異性的相對(duì)均勻直徑,；膠原纖維以高度有序的橫向排列,。這種精確的膠原纖維板層的排列對(duì)于維持角膜的生物力學(xué)和光學(xué)特性（包括透明度）至關(guān)重要。在任何重大眼部損傷如深度切割,、燒傷或感染的情況下,，靠近Bowman膜的靜止角膜細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡，其他角膜細(xì)胞在分泌的白細(xì)胞介素,、TGF-β和中性粒細(xì)胞分泌的刺激下被激活,，并形成成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，它們分泌異常和過(guò)量的ECM成分,。這破壞了基質(zhì)的有序纖維排列,，導(dǎo)致角膜混濁。角膜失明的流行病學(xué)多樣,，并在很大程度上受特定地理位置眼病流行的影響,。目前，盡管全球估計(jì)有2000萬(wàn)人患有角膜失明,，但由于健康捐獻(xiàn)者的嚴(yán)重短缺,，只有1.5%的人受益于角膜移植。盡管面臨未滿足的臨床需求,、移植排斥和供體組織引起的感染等挑戰(zhàn),，角膜移植仍然是恢復(fù)患者視力的黃金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。因此,，生物打印一種具有彈性且光學(xué)透明的角膜組織替代品仍然是一個(gè)挑戰(zhàn),。

來(lái)自印度海得拉巴理工學(xué)院的 Falguni Pati團(tuán)隊(duì)引入了一種創(chuàng)新的方法，旨在增強(qiáng)絲素蛋白（SF）水凝膠的機(jī)械和光學(xué)特性,，這對(duì)于角膜組織工程的發(fā)展至關(guān)重要,。本文設(shè)計(jì)了一種獨(dú)特的曙紅Y基光引發(fā)劑系統(tǒng)，在綠光照射下,，通過(guò)二酪氨酸鍵合高度濃縮的純SF溶液,。這一開(kāi)創(chuàng)性的技術(shù)使得SF水凝膠通過(guò)二酪氨酸共價(jià)鍵得到加固，同時(shí)保持了卓越的透明度和柔軟的彈性特質(zhì)，避免了自發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)橛捕�不透明的�?折疊構(gòu)象,。此外,，本文將SF與脫細(xì)胞角膜基質(zhì)（DCM）水凝膠結(jié)合使用，利用綠光下的光聚合和隨后的熱凝膠化來(lái)建立堅(jiān)韌穩(wěn)定的凝膠形成,。由此產(chǎn)生的雙交聯(lián)混合水凝膠在機(jī)械強(qiáng)度和熱穩(wěn)定性方面優(yōu)于雙交聯(lián)的DCM水凝膠,。SF在DCM中的加入進(jìn)一步增強(qiáng)了水凝膠的彈性和剪切恢復(fù)能力，使其成為角膜生物打印的理想生物墨水,。在擠出打印過(guò)程中，生物墨水的光交聯(lián)表層通過(guò)二酪氨酸鍵合加固了SF和DCM聚合物鏈,，提供了初始的穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度,。隨后的后打印熱凝膠化進(jìn)一步通過(guò)自組裝強(qiáng)化了膠原纖維鏈。值得注意的是,，含有人類角膜緣間充質(zhì)干細(xì)胞的生物打印角膜結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出透明度,、結(jié)構(gòu)完整性和最佳功能，這由角化細(xì)胞蛋白聚糖的表達(dá)所證明,�,？偟膩�(lái)說(shuō)，本文的工程化的3D構(gòu)建體展現(xiàn)出在角膜組織工程中體內(nèi)應(yīng)用的前景,，標(biāo)志著該領(lǐng)域向前邁進(jìn)了一大步,。相關(guān)工作以題為“Bioprinting a resilient and transparent cornea stroma equivalent: harnessing dual crosslinking strategy with decellularized cornea matrix and silk fibroin hybrid”的文章發(fā)表在2024年12月04日的期刊《Biofabrication》。

   

【雙交聯(lián)DCM/SF雜化水凝膠的制備】
在交聯(lián)的初始步驟中,，曙紅Y與其共引發(fā)劑TEA和共聚單體NVP一起被用來(lái)加快可見(jiàn)光基交聯(lián)過(guò)程的凝膠化動(dòng)力學(xué),。在可見(jiàn)光照射下，曙紅Y轉(zhuǎn)變?yōu)槠淙�重態(tài),，從TEA中抽取氫原子并中和自身,，從而產(chǎn)生TEA陽(yáng)離子自由基。去質(zhì)子的TEA通過(guò)在單體鏈中引發(fā)自由基中心來(lái)啟動(dòng)聚合反應(yīng),，導(dǎo)致形成穩(wěn)定的交聯(lián)凝膠網(wǎng)絡(luò),。圖1(a)展示了DCM與SF混合過(guò)程及雙交聯(lián)機(jī)制的示意圖。   

圖1 在絲素蛋白水凝膠中通過(guò)eosin Y介導(dǎo)的二酪氨酸鍵形成的機(jī)制示意圖,，以及DCM/SF混合水凝膠的雙重交聯(lián)示意圖

【光引發(fā)劑與SF濃度的優(yōu)化】
SF鏈主要由甘氨酸,、丙氨酸和絲氨酸組成，酪氨酸和其他氨基酸殘基的含量極少,。在本文中,，SF溶液的交聯(lián)通過(guò)二酪氨酸鍵實(shí)現(xiàn)。因此,，絲中僅有5%的酪氨酸殘基解釋了為什么需要使用如此高濃度（18%）的絲溶液進(jìn)行熒光素Y介導(dǎo)的交聯(lián),。然而，將SF溶液的濃度降低到11%–12%會(huì)導(dǎo)致形成半交聯(lián)的漿狀凝膠，這些凝膠缺乏形狀和結(jié)構(gòu)保真度,，即使在更高的光引發(fā)劑濃度下也是如此（圖2(a)）,。因此，足夠的酪氨酸氨基酸殘基的存在對(duì)于促進(jìn)形成的酪氨酰自由基接近是至關(guān)重要的,，這是形成二酪氨酸鍵所必需的,。   

圖2 雙重交聯(lián)DCM和DCM/SF混合水凝膠的物理表征

【DCM和DCVM/SF混合水凝膠的透明度】
光交聯(lián)增強(qiáng)了DCM水凝膠的透明度，而熱交聯(lián)則迅速自組裝膠原蛋白鏈,，導(dǎo)致凝膠半透明,，這是因?yàn)樽璧K了光的前向干涉并促進(jìn)了背向散射。然而,，光交聯(lián)通過(guò)表層交聯(lián)DCM鏈,，防止了膠原蛋白自發(fā)組裝。光交聯(lián)的DCM水凝膠達(dá)到了約85%的透明度,，而熱凝膠化使透明度降低到約70%,。另一方面，光交聯(lián)的SF水凝膠表現(xiàn)出高透明度,。將絲加入DCM水凝膠進(jìn)一步提高了透明度,，在雙交聯(lián)混合水凝膠中達(dá)到88%（圖2(b)）。所有水凝膠支架的宏觀圖像如圖3(c)所示,，用于視覺(jué)上澄清透明度數(shù)據(jù),。

圖3 雙重交聯(lián)DCM和DCM/SF混合水凝膠頂部種植或包埋hLMSCs的生物相容性

【SF、DCM和雜交水凝膠的粘度曲線與剪切恢復(fù)】
將SF加入到DCM水凝膠中后,，觀察到流變性質(zhì)出現(xiàn)了有趣的變化,。最初，90:10 DCM/SF雜交水凝膠的行為與DCM水凝膠相似,，盡管在0.01 s−1的剪切速率下初始粘度略低,，這可能是因?yàn)榧尤肓?0%（體積比）的SF。然而,，當(dāng)DCM水凝膠中SF的體積百分比從20%增加到30%時(shí),，其剪切稀化行為的程度有所降低。80:20（體積比）和70:30（體積比）的DCM/SF雜交水凝膠表現(xiàn)出觸變性行為,，介于DCM和18% SF水凝膠之間,。這些水凝膠在高達(dá)1 s−1的剪切速率下顯示出強(qiáng)烈的剪切稀化特性，超過(guò)這一速率后剪切稀化程度減少,，并在100–1500 s−1的剪切速率范圍內(nèi)表現(xiàn)出牛頓流體行為,。進(jìn)一步增加剪切速率則導(dǎo)致剪切增稠特性。因此,，SF的加入影響了DCM水凝膠的流變性質(zhì),，影響程度隨SF濃度的不同而異。然而，這種效應(yīng)在90:10（體積比）DCM/SF雜交水凝膠中不太明顯,，主要是因?yàn)镾F的添加量較少,，偏離了DCM水凝膠的流變特性（圖4(a)）。

除了粘度外,，水凝膠在經(jīng)歷剪切應(yīng)力后能否恢復(fù)到初始粘度對(duì)于保持打印結(jié)構(gòu)的完整性至關(guān)重要,。為評(píng)估這一點(diǎn)，對(duì)可雙重交聯(lián)的DCM和DCM/SF水凝膠進(jìn)行了不同剪切速率下的測(cè)試,，持續(xù)20秒,，然后在移除剪切力后計(jì)算粘度恢復(fù)百分比。DCM水凝膠部分恢復(fù)了其初始粘度,，分別在100 s−1,、500 s−1和1000 s−1的剪切速率下觀察到約50.5%和近70%的恢復(fù)。相比之下,，DCM/SF水凝膠在所有三種不同的剪切速率下都表現(xiàn)出顯著優(yōu)于DCM水凝膠的剪切恢復(fù)性能，其初始粘度的恢復(fù)率在90%-94%之間（圖4(b)）,。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了加入SF溶液對(duì)DCM水凝膠剪切恢復(fù)性質(zhì)的有益影響,。這種恢復(fù)潛力的提高表明，DCM/SF水凝膠可能在打印結(jié)構(gòu)中提供更好的保真度,，突顯了這種雜交材料在各種應(yīng)用中的潛力,。   

圖4 流變分析與打印參數(shù)優(yōu)化

【DCM和DCM/SF混合生物墨水的生物打印參數(shù)優(yōu)化】
接下來(lái)，為了找到增加打印速度對(duì)細(xì)胞存活百分比的影響,，本文使用hLMSC包裹的DCM和DCM/SF水凝膠,，以1 mm s−1到50 mm s−1的不同速度打印了10 × 15毫米的片狀結(jié)構(gòu)（單層）。這些水凝膠經(jīng)過(guò)雙重交聯(lián)處理,，并在培養(yǎng)1天后進(jìn)行死活檢測(cè)（圖5(a)–(d)）,。在非常低的打印速度下，從1 mm s−1到5 mm s−1,，兩種水凝膠的細(xì)胞存活百分比最高,，分別為86%到87%，但細(xì)胞在整個(gè)打印結(jié)構(gòu)中隨機(jī)分布,。然而,，隨著打印速度從10 mm s−1增加到20 mm s−1，本文在打印的水凝膠片內(nèi)觀察到細(xì)胞呈圖案化排列,，兩種水凝膠的細(xì)胞存活率均為80%–84%,。在擠出打印過(guò)程中，施加剪切應(yīng)力時(shí),，生物墨水聚合物在擠出過(guò)程中解纏結(jié),，被擠出后，聚合物鏈嘗試重新取向流動(dòng)方向，導(dǎo)致細(xì)胞包裹的聚合物絲束排列整齊,。這種現(xiàn)象在較高的打印速度下更為顯著,。在25 mm s−1到30 mm s−1的打印速度下，細(xì)胞存活率下降到60%–70%,，而在最高的40 mm s−1和50 mm s−1的打印速度下,，兩種水凝膠的細(xì)胞存活率急劇下降到50%（圖5(c)和(d)）。因此,，基于打印線條的保真度,、細(xì)胞存活百分比以及水凝膠結(jié)構(gòu)內(nèi)細(xì)胞的圖案化排列，本文將功能性角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)的生物打印窗口優(yōu)化為20 mm s−1到25 mm s−1,。   

圖5 打印參數(shù)優(yōu)化

【角膜結(jié)構(gòu)的生物打印及其特征描述】
在優(yōu)化打印參數(shù)后,，以22 mm s−1的速度和0.2 bar的壓力使用330 µm的噴嘴生物打印了雙層角膜結(jié)構(gòu)。得到的12.6 × 12.8 mm的DCM和DCM/SF角膜結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出柔韌性,，表明它們的彈性特性,。通過(guò)攝影評(píng)估視覺(jué)清晰度，發(fā)現(xiàn)DCM和DCM/SF角膜結(jié)構(gòu)顯示出不同程度的透明度（圖6(a)）,。理想情況下,，雙層打印結(jié)構(gòu)的厚度應(yīng)約為660 µm。然而,，由于生物墨水的擴(kuò)散,，實(shí)際雙層打印結(jié)構(gòu)的近似厚度為550–600 µm。使用純凈,、高度濃縮的SF溶液進(jìn)行角膜基質(zhì)的生物打印時(shí),，以10 mm s−1的速度和極小的0.1 bar壓力進(jìn)行。所有結(jié)構(gòu)均采用平行圖案幾何形狀打印,，其中SF角膜結(jié)構(gòu)顯示出最高的光學(xué)清晰度,，其在700 nm處的透光率為90%。雙重交聯(lián)的DCM結(jié)構(gòu)顯示出80%的透明度,，相當(dāng)于DCM-pregel,，而雜交角膜結(jié)構(gòu)的透光率更高，達(dá)到87%（圖6(b)）,。

圖6 生物打印角膜結(jié)構(gòu)以及角膜結(jié)構(gòu)的透明度對(duì)比

【生物打印角膜結(jié)構(gòu)的免疫染色和RT-PCR】
為評(píng)估打印的角膜基質(zhì)三維環(huán)境中hLMSCs的功能,，本文進(jìn)行了免疫熒光研究，檢測(cè)了角化細(xì)胞核心蛋白,，包括KS,、KERA、LUM,、CD34和ALDH3A1,。DCM和DCM/SF生物打印角膜結(jié)構(gòu)在培養(yǎng)第7天固定,，并用這些標(biāo)記蛋白染色（圖7(a)）。結(jié)果顯示,，包埋在DCM和DCM/SF角膜結(jié)構(gòu)中的hLMSCs均表現(xiàn)出高水平的KS,、KERA和LUM表達(dá)。此外,，hLMSCs在DCM和DCM/SF水凝膠中分化為角化細(xì)胞,，通過(guò)角膜角化細(xì)胞特異性標(biāo)記物CD34和ALDH3A1的表達(dá)來(lái)表明（圖7(a)）。另外,，使用鬼筆環(huán)肽染色可視化hLMSCs的形態(tài),，以觀察細(xì)胞骨架F-肌動(dòng)蛋白，而細(xì)胞核用DAPI染色,。鬼筆環(huán)肽染色確認(rèn)了包埋在生物打印結(jié)構(gòu)中的hLMSCs的紡錘形形態(tài)（圖7(a)）,。圖7(b)顯示了鬼筆環(huán)肽、KS和DAPI的三重合并圖像,，用于DCM和DCM/SF角膜結(jié)構(gòu),，證明了hLMSCs在DCM的類原生微環(huán)境中分化為角化細(xì)胞并表達(dá)了角化細(xì)胞核心蛋白。值得注意的是,，DCM中加入SF并未影響hLMSCs的功能,，因?yàn)槲从^察到表達(dá)水平的差異。2D對(duì)照（hLMSC在TCP中培養(yǎng)7天）的KERA和LUM免疫染色未顯示出兩種蛋白的任何顯著表達(dá),。   

圖7 通過(guò)免疫染色檢查包裹在DCM和DCM/SF生物墨水角膜結(jié)構(gòu)中的hLMSC標(biāo)記表達(dá)

此外，鬼筆環(huán)肽染色表明hLMSC的形態(tài)更廣泛,，這與包埋在生物打印結(jié)構(gòu)中的hLMSC較長(zhǎng)的紡錘形態(tài)不同（圖7(c)）,。陰性對(duì)照（無(wú)細(xì)胞的DCM-PCT和DCM/SF-PCT支架）也未顯示出KERA和LUM的任何表達(dá)（圖7(c)）。這些結(jié)果表明,，DCM和DCM/SF角膜結(jié)構(gòu)都提供了有利于hLMSC分化為角化細(xì)胞的環(huán)境,，促進(jìn)了角化細(xì)胞核心蛋白的表達(dá)。RT-PCR分析表明,，DCM-PCT或DCM/SF-PCT生物打印結(jié)構(gòu)中KERA的表達(dá)沒(méi)有顯著差異,，而LUM在DCM-PCT中的表達(dá)略高于DCM/SF-PCT（圖8）。在DCM中加入10%（V/V）的SF不會(huì)影響hLMSCs的功能,，確保其在生物打印結(jié)構(gòu)中有效分化,。

圖8 通過(guò)RT-PCR檢測(cè)包裹在DCM和DCM/SF-PCT生物打印結(jié)構(gòu)中的hLMSC的KERA和LUM表達(dá)

【總結(jié)與展望】
本研究介紹了一種利用曙紅Y介導(dǎo)的可見(jiàn)光交聯(lián)濃縮SF溶液的新方法，形成了具有卓越透明度和彈性的SF水凝膠,，楊氏模量達(dá)到0.5 MPa,。這些SF水凝膠表現(xiàn)出時(shí)間依賴性的硬化特性，同時(shí)保持顯著的彈性屬性,。此外,，本文將10%（體積/體積）的SF摻入DCM水凝膠中,，并對(duì)混合水凝膠進(jìn)行雙交聯(lián)處理：首先在綠光照射下進(jìn)行5分鐘的曙紅Y介導(dǎo)交聯(lián)，隨后在37℃下進(jìn)行熱凝膠化以完成膠原纖維自組裝,。這種SF與DCM的協(xié)同整合以及雙交聯(lián)顯著增強(qiáng)了DCM水凝膠的熱性能和機(jī)械性能,，應(yīng)力-應(yīng)變壓縮曲線的斷裂應(yīng)變點(diǎn)左移，表明彈性強(qiáng)度增加,。在雙重交聯(lián)的水凝膠表面種植hLMSCs后,，細(xì)胞存活率達(dá)到了驚人的90%。為了將hLMSCs包裹在水凝膠內(nèi),，本文調(diào)整了曙紅Y的濃度并增加了DCM的濃度,，以減輕細(xì)胞毒性的同時(shí)確保穩(wěn)定的凝膠形成。光聚合提供了額外的優(yōu)勢(shì),，即表層交聯(lián)聚合物鏈,，使得這一過(guò)程高度兼容生物制造方法。最終生物打印出的角膜結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出堅(jiān)固的結(jié)構(gòu)完整性及最佳的角化細(xì)胞功能核心蛋白表達(dá),�,？傊�，本文的SF摻入雙交聯(lián)方法為制造高透明,、有彈性的角膜結(jié)構(gòu)提供了一種有前景的方法,，具有潛在的體內(nèi)應(yīng)用價(jià)值。   

文章來(lái)源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ad9409