來源: EngineeringForLife
角膜是一種透明,、無血管的組織,作為眼睛的前窗,,對(duì)視力至關(guān)重要,。角膜厚度的90%由高度有序的基質(zhì)層組成,其中央厚度為470–500微米,�,;|(zhì)層中的膠原纖維有兩個(gè)顯著特征:纖維較窄且具有物種特異性的相對(duì)均勻直徑;膠原纖維以高度有序的橫向排列,。這種精確的膠原纖維板層的排列對(duì)于維持角膜的生物力學(xué)和光學(xué)特性(包括透明度)至關(guān)重要,。在任何重大眼部損傷如深度切割、燒傷或感染的情況下,靠近Bowman膜的靜止角膜細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡,,其他角膜細(xì)胞在分泌的白細(xì)胞介素,、TGF-β和中性粒細(xì)胞分泌的刺激下被激活,并形成成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞,,它們分泌異常和過量的ECM成分,。這破壞了基質(zhì)的有序纖維排列,導(dǎo)致角膜混濁,。角膜失明的流行病學(xué)多樣,,并在很大程度上受特定地理位置眼病流行的影響。目前,,盡管全球估計(jì)有2000萬人患有角膜失明,,但由于健康捐獻(xiàn)者的嚴(yán)重短缺,只有1.5%的人受益于角膜移植,。盡管面臨未滿足的臨床需求,、移植排斥和供體組織引起的感染等挑戰(zhàn),角膜移植仍然是恢復(fù)患者視力的黃金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù),。因此,,生物打印一種具有彈性且光學(xué)透明的角膜組織替代品仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。
來自印度海得拉巴理工學(xué)院的 Falguni Pati團(tuán)隊(duì)引入了一種創(chuàng)新的方法,,旨在增強(qiáng)絲素蛋白(SF)水凝膠的機(jī)械和光學(xué)特性,,這對(duì)于角膜組織工程的發(fā)展至關(guān)重要。本文設(shè)計(jì)了一種獨(dú)特的曙紅Y基光引發(fā)劑系統(tǒng),,在綠光照射下,,通過二酪氨酸鍵合高度濃縮的純SF溶液。這一開創(chuàng)性的技術(shù)使得SF水凝膠通過二酪氨酸共價(jià)鍵得到加固,,同時(shí)保持了卓越的透明度和柔軟的彈性特質(zhì),,避免了自發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)橛捕煌该鞯摩?折疊構(gòu)象。此外,,本文將SF與脫細(xì)胞角膜基質(zhì)(DCM)水凝膠結(jié)合使用,,利用綠光下的光聚合和隨后的熱凝膠化來建立堅(jiān)韌穩(wěn)定的凝膠形成。由此產(chǎn)生的雙交聯(lián)混合水凝膠在機(jī)械強(qiáng)度和熱穩(wěn)定性方面優(yōu)于雙交聯(lián)的DCM水凝膠,。SF在DCM中的加入進(jìn)一步增強(qiáng)了水凝膠的彈性和剪切恢復(fù)能力,,使其成為角膜生物打印的理想生物墨水。在擠出打印過程中,,生物墨水的光交聯(lián)表層通過二酪氨酸鍵合加固了SF和DCM聚合物鏈,,提供了初始的穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度。隨后的后打印熱凝膠化進(jìn)一步通過自組裝強(qiáng)化了膠原纖維鏈,。值得注意的是,,含有人類角膜緣間充質(zhì)干細(xì)胞的生物打印角膜結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出透明度,、結(jié)構(gòu)完整性和最佳功能,,這由角化細(xì)胞蛋白聚糖的表達(dá)所證明,。總的來說,,本文的工程化的3D構(gòu)建體展現(xiàn)出在角膜組織工程中體內(nèi)應(yīng)用的前景,,標(biāo)志著該領(lǐng)域向前邁進(jìn)了一大步。相關(guān)工作以題為“Bioprinting a resilient and transparent cornea stroma equivalent: harnessing dual crosslinking strategy with decellularized cornea matrix and silk fibroin hybrid”的文章發(fā)表在2024年12月04日的期刊《Biofabrication》,。
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2024-12-30 10:10 上傳
【雙交聯(lián)DCM/SF雜化水凝膠的制備】
在交聯(lián)的初始步驟中,,曙紅Y與其共引發(fā)劑TEA和共聚單體NVP一起被用來加快可見光基交聯(lián)過程的凝膠化動(dòng)力學(xué)。在可見光照射下,,曙紅Y轉(zhuǎn)變?yōu)槠淙貞B(tài),,從TEA中抽取氫原子并中和自身,從而產(chǎn)生TEA陽離子自由基,。去質(zhì)子的TEA通過在單體鏈中引發(fā)自由基中心來啟動(dòng)聚合反應(yīng),,導(dǎo)致形成穩(wěn)定的交聯(lián)凝膠網(wǎng)絡(luò)。圖1(a)展示了DCM與SF混合過程及雙交聯(lián)機(jī)制的示意圖,。
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圖1 在絲素蛋白水凝膠中通過eosin Y介導(dǎo)的二酪氨酸鍵形成的機(jī)制示意圖,,以及DCM/SF混合水凝膠的雙重交聯(lián)示意圖
【光引發(fā)劑與SF濃度的優(yōu)化】
SF鏈主要由甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸組成,,酪氨酸和其他氨基酸殘基的含量極少,。在本文中,SF溶液的交聯(lián)通過二酪氨酸鍵實(shí)現(xiàn),。因此,,絲中僅有5%的酪氨酸殘基解釋了為什么需要使用如此高濃度(18%)的絲溶液進(jìn)行熒光素Y介導(dǎo)的交聯(lián)。然而,,將SF溶液的濃度降低到11%–12%會(huì)導(dǎo)致形成半交聯(lián)的漿狀凝膠,,這些凝膠缺乏形狀和結(jié)構(gòu)保真度,即使在更高的光引發(fā)劑濃度下也是如此(圖2(a)),。因此,,足夠的酪氨酸氨基酸殘基的存在對(duì)于促進(jìn)形成的酪氨酰自由基接近是至關(guān)重要的,這是形成二酪氨酸鍵所必需的,。
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圖2 雙重交聯(lián)DCM和DCM/SF混合水凝膠的物理表征
【DCM和DCVM/SF混合水凝膠的透明度】
光交聯(lián)增強(qiáng)了DCM水凝膠的透明度,,而熱交聯(lián)則迅速自組裝膠原蛋白鏈,導(dǎo)致凝膠半透明,,這是因?yàn)樽璧K了光的前向干涉并促進(jìn)了背向散射,。然而,光交聯(lián)通過表層交聯(lián)DCM鏈,,防止了膠原蛋白自發(fā)組裝,。光交聯(lián)的DCM水凝膠達(dá)到了約85%的透明度,而熱凝膠化使透明度降低到約70%。另一方面,,光交聯(lián)的SF水凝膠表現(xiàn)出高透明度,。將絲加入DCM水凝膠進(jìn)一步提高了透明度,在雙交聯(lián)混合水凝膠中達(dá)到88%(圖2(b)),。所有水凝膠支架的宏觀圖像如圖3(c)所示,,用于視覺上澄清透明度數(shù)據(jù)。
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圖3 雙重交聯(lián)DCM和DCM/SF混合水凝膠頂部種植或包埋hLMSCs的生物相容性
【SF,、DCM和雜交水凝膠的粘度曲線與剪切恢復(fù)】
將SF加入到DCM水凝膠中后,,觀察到流變性質(zhì)出現(xiàn)了有趣的變化。最初,,90:10 DCM/SF雜交水凝膠的行為與DCM水凝膠相似,,盡管在0.01 s−1的剪切速率下初始粘度略低,這可能是因?yàn)榧尤肓?0%(體積比)的SF,。然而,,當(dāng)DCM水凝膠中SF的體積百分比從20%增加到30%時(shí),其剪切稀化行為的程度有所降低,。80:20(體積比)和70:30(體積比)的DCM/SF雜交水凝膠表現(xiàn)出觸變性行為,,介于DCM和18% SF水凝膠之間。這些水凝膠在高達(dá)1 s−1的剪切速率下顯示出強(qiáng)烈的剪切稀化特性,,超過這一速率后剪切稀化程度減少,,并在100–1500 s−1的剪切速率范圍內(nèi)表現(xiàn)出牛頓流體行為。進(jìn)一步增加剪切速率則導(dǎo)致剪切增稠特性,。因此,,SF的加入影響了DCM水凝膠的流變性質(zhì),影響程度隨SF濃度的不同而異,。然而,,這種效應(yīng)在90:10(體積比)DCM/SF雜交水凝膠中不太明顯,主要是因?yàn)镾F的添加量較少,,偏離了DCM水凝膠的流變特性(圖4(a)),。
除了粘度外,水凝膠在經(jīng)歷剪切應(yīng)力后能否恢復(fù)到初始粘度對(duì)于保持打印結(jié)構(gòu)的完整性至關(guān)重要,。為評(píng)估這一點(diǎn),,對(duì)可雙重交聯(lián)的DCM和DCM/SF水凝膠進(jìn)行了不同剪切速率下的測試,持續(xù)20秒,,然后在移除剪切力后計(jì)算粘度恢復(fù)百分比,。DCM水凝膠部分恢復(fù)了其初始粘度,分別在100 s−1,、500 s−1和1000 s−1的剪切速率下觀察到約50.5%和近70%的恢復(fù),。相比之下,,DCM/SF水凝膠在所有三種不同的剪切速率下都表現(xiàn)出顯著優(yōu)于DCM水凝膠的剪切恢復(fù)性能,其初始粘度的恢復(fù)率在90%-94%之間(圖4(b)),。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了加入SF溶液對(duì)DCM水凝膠剪切恢復(fù)性質(zhì)的有益影響,。這種恢復(fù)潛力的提高表明,DCM/SF水凝膠可能在打印結(jié)構(gòu)中提供更好的保真度,,突顯了這種雜交材料在各種應(yīng)用中的潛力。
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圖4 流變分析與打印參數(shù)優(yōu)化
【DCM和DCM/SF混合生物墨水的生物打印參數(shù)優(yōu)化】
接下來,,為了找到增加打印速度對(duì)細(xì)胞存活百分比的影響,,本文使用hLMSC包裹的DCM和DCM/SF水凝膠,以1 mm s−1到50 mm s−1的不同速度打印了10 × 15毫米的片狀結(jié)構(gòu)(單層),。這些水凝膠經(jīng)過雙重交聯(lián)處理,,并在培養(yǎng)1天后進(jìn)行死活檢測(圖5(a)–(d))。在非常低的打印速度下,,從1 mm s−1到5 mm s−1,,兩種水凝膠的細(xì)胞存活百分比最高,分別為86%到87%,,但細(xì)胞在整個(gè)打印結(jié)構(gòu)中隨機(jī)分布,。然而,隨著打印速度從10 mm s−1增加到20 mm s−1,,本文在打印的水凝膠片內(nèi)觀察到細(xì)胞呈圖案化排列,,兩種水凝膠的細(xì)胞存活率均為80%–84%。在擠出打印過程中,,施加剪切應(yīng)力時(shí),,生物墨水聚合物在擠出過程中解纏結(jié),被擠出后,,聚合物鏈嘗試重新取向流動(dòng)方向,,導(dǎo)致細(xì)胞包裹的聚合物絲束排列整齊。這種現(xiàn)象在較高的打印速度下更為顯著,。在25 mm s−1到30 mm s−1的打印速度下,,細(xì)胞存活率下降到60%–70%,而在最高的40 mm s−1和50 mm s−1的打印速度下,,兩種水凝膠的細(xì)胞存活率急劇下降到50%(圖5(c)和(d)),。因此,基于打印線條的保真度,、細(xì)胞存活百分比以及水凝膠結(jié)構(gòu)內(nèi)細(xì)胞的圖案化排列,,本文將功能性角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)的生物打印窗口優(yōu)化為20 mm s−1到25 mm s−1。
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圖5 打印參數(shù)優(yōu)化
【角膜結(jié)構(gòu)的生物打印及其特征描述】
在優(yōu)化打印參數(shù)后,,以22 mm s−1的速度和0.2 bar的壓力使用330 µm的噴嘴生物打印了雙層角膜結(jié)構(gòu),。得到的12.6 × 12.8 mm的DCM和DCM/SF角膜結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出柔韌性,,表明它們的彈性特性。通過攝影評(píng)估視覺清晰度,,發(fā)現(xiàn)DCM和DCM/SF角膜結(jié)構(gòu)顯示出不同程度的透明度(圖6(a)),。理想情況下,雙層打印結(jié)構(gòu)的厚度應(yīng)約為660 µm,。然而,,由于生物墨水的擴(kuò)散,實(shí)際雙層打印結(jié)構(gòu)的近似厚度為550–600 µm,。使用純凈,、高度濃縮的SF溶液進(jìn)行角膜基質(zhì)的生物打印時(shí),以10 mm s−1的速度和極小的0.1 bar壓力進(jìn)行,。所有結(jié)構(gòu)均采用平行圖案幾何形狀打印,,其中SF角膜結(jié)構(gòu)顯示出最高的光學(xué)清晰度,其在700 nm處的透光率為90%,。雙重交聯(lián)的DCM結(jié)構(gòu)顯示出80%的透明度,,相當(dāng)于DCM-pregel,而雜交角膜結(jié)構(gòu)的透光率更高,,達(dá)到87%(圖6(b)),。
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圖6 生物打印角膜結(jié)構(gòu)以及角膜結(jié)構(gòu)的透明度對(duì)比
【生物打印角膜結(jié)構(gòu)的免疫染色和RT-PCR】
為評(píng)估打印的角膜基質(zhì)三維環(huán)境中hLMSCs的功能,本文進(jìn)行了免疫熒光研究,,檢測了角化細(xì)胞核心蛋白,,包括KS、KERA,、LUM,、CD34和ALDH3A1。DCM和DCM/SF生物打印角膜結(jié)構(gòu)在培養(yǎng)第7天固定,,并用這些標(biāo)記蛋白染色(圖7(a)),。結(jié)果顯示,包埋在DCM和DCM/SF角膜結(jié)構(gòu)中的hLMSCs均表現(xiàn)出高水平的KS,、KERA和LUM表達(dá),。此外,hLMSCs在DCM和DCM/SF水凝膠中分化為角化細(xì)胞,,通過角膜角化細(xì)胞特異性標(biāo)記物CD34和ALDH3A1的表達(dá)來表明(圖7(a)),。另外,使用鬼筆環(huán)肽染色可視化hLMSCs的形態(tài),,以觀察細(xì)胞骨架F-肌動(dòng)蛋白,,而細(xì)胞核用DAPI染色。鬼筆環(huán)肽染色確認(rèn)了包埋在生物打印結(jié)構(gòu)中的hLMSCs的紡錘形形態(tài)(圖7(a)),。圖7(b)顯示了鬼筆環(huán)肽,、KS和DAPI的三重合并圖像,,用于DCM和DCM/SF角膜結(jié)構(gòu),證明了hLMSCs在DCM的類原生微環(huán)境中分化為角化細(xì)胞并表達(dá)了角化細(xì)胞核心蛋白,。值得注意的是,,DCM中加入SF并未影響hLMSCs的功能,因?yàn)槲从^察到表達(dá)水平的差異,。2D對(duì)照(hLMSC在TCP中培養(yǎng)7天)的KERA和LUM免疫染色未顯示出兩種蛋白的任何顯著表達(dá),。
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圖7 通過免疫染色檢查包裹在DCM和DCM/SF生物墨水角膜結(jié)構(gòu)中的hLMSC標(biāo)記表達(dá)
此外,鬼筆環(huán)肽染色表明hLMSC的形態(tài)更廣泛,,這與包埋在生物打印結(jié)構(gòu)中的hLMSC較長的紡錘形態(tài)不同(圖7(c)),。陰性對(duì)照(無細(xì)胞的DCM-PCT和DCM/SF-PCT支架)也未顯示出KERA和LUM的任何表達(dá)(圖7(c))。這些結(jié)果表明,,DCM和DCM/SF角膜結(jié)構(gòu)都提供了有利于hLMSC分化為角化細(xì)胞的環(huán)境,促進(jìn)了角化細(xì)胞核心蛋白的表達(dá),。RT-PCR分析表明,,DCM-PCT或DCM/SF-PCT生物打印結(jié)構(gòu)中KERA的表達(dá)沒有顯著差異,而LUM在DCM-PCT中的表達(dá)略高于DCM/SF-PCT(圖8),。在DCM中加入10%(V/V)的SF不會(huì)影響hLMSCs的功能,,確保其在生物打印結(jié)構(gòu)中有效分化。
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圖8 通過RT-PCR檢測包裹在DCM和DCM/SF-PCT生物打印結(jié)構(gòu)中的hLMSC的KERA和LUM表達(dá)
【總結(jié)與展望】
本研究介紹了一種利用曙紅Y介導(dǎo)的可見光交聯(lián)濃縮SF溶液的新方法,,形成了具有卓越透明度和彈性的SF水凝膠,,楊氏模量達(dá)到0.5 MPa。這些SF水凝膠表現(xiàn)出時(shí)間依賴性的硬化特性,,同時(shí)保持顯著的彈性屬性,。此外,本文將10%(體積/體積)的SF摻入DCM水凝膠中,,并對(duì)混合水凝膠進(jìn)行雙交聯(lián)處理:首先在綠光照射下進(jìn)行5分鐘的曙紅Y介導(dǎo)交聯(lián),,隨后在37℃下進(jìn)行熱凝膠化以完成膠原纖維自組裝。這種SF與DCM的協(xié)同整合以及雙交聯(lián)顯著增強(qiáng)了DCM水凝膠的熱性能和機(jī)械性能,,應(yīng)力-應(yīng)變壓縮曲線的斷裂應(yīng)變點(diǎn)左移,,表明彈性強(qiáng)度增加。在雙重交聯(lián)的水凝膠表面種植hLMSCs后,,細(xì)胞存活率達(dá)到了驚人的90%,。為了將hLMSCs包裹在水凝膠內(nèi),本文調(diào)整了曙紅Y的濃度并增加了DCM的濃度,,以減輕細(xì)胞毒性的同時(shí)確保穩(wěn)定的凝膠形成,。光聚合提供了額外的優(yōu)勢,即表層交聯(lián)聚合物鏈,,使得這一過程高度兼容生物制造方法,。最終生物打印出的角膜結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出堅(jiān)固的結(jié)構(gòu)完整性及最佳的角化細(xì)胞功能核心蛋白表達(dá),。總之,,本文的SF摻入雙交聯(lián)方法為制造高透明,、有彈性的角膜結(jié)構(gòu)提供了一種有前景的方法,具有潛在的體內(nèi)應(yīng)用價(jià)值,。
文章來源:
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ad9409
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