《Bioact. Mater.》：高機(jī)械穩(wěn)定性的3D打印生物水凝膠

來源： EFL生物3D打印與生物制造

3D打印允許在微米級(jí)別上對結(jié)構(gòu)進(jìn)行控制，同時(shí)精確控制多種細(xì)胞類型的位置以創(chuàng)建與原生組織相匹配的復(fù)雜結(jié)構(gòu),。生物水凝膠由于其生物相容性、明確的細(xì)胞黏附配體以及生物降解性（允許細(xì)胞遷移并為大分子和小分子的傳輸提供有利條件）,，被廣泛用作細(xì)胞3D打印的生物墨水,。水凝膠具有類似原生組織的粘彈性，通常具有較低的剪切模量,，在某些情況下表現(xiàn)出剪切稀化行為,，這使得在存在細(xì)胞的情況下能夠輕松進(jìn)行擠出打印。纖維蛋白,、明膠甲基丙烯酸酯（GelMA）和膠原蛋白甲基丙烯酸酯（ColMA）等水凝膠被認(rèn)為是生物制造各種結(jié)構(gòu)用于多種應(yīng)用的金標(biāo)準(zhǔn),。例如，GelMA因其在組織工程中的廣泛應(yīng)用而受到廣泛關(guān)注,，特別是在血管化和心臟組織工程方面,，它作為3D打印的生物墨水，并在再生醫(yī)學(xué)中作為傷口愈合的粘合墨水,。然而,，幾何和結(jié)構(gòu)完整性在3D打印的細(xì)胞負(fù)載構(gòu)建物中隨著時(shí)間的推移往往會(huì)因細(xì)胞壓實(shí)和水凝膠收縮而惡化。

來自加拿大多倫多大學(xué)的Milica Radisic團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種新的方法,，該方法結(jié)合了生物水凝膠的細(xì)胞相容性和彈性聚合物的機(jī)械穩(wěn)定性,，以維持立體光刻和擠出3D打印后的結(jié)構(gòu)保真度。實(shí)現(xiàn)這一進(jìn)展的是復(fù)合生物墨水,，通過將來自聚(八亞甲基順丁烯二酸酐檸檬酸酯)（POMaC）的彈性微粒整合到生物源性水凝膠（纖維蛋白,、明膠甲基丙烯酸酯（GelMA）和藻酸鹽）中來配制。這種復(fù)合生物墨水增強(qiáng)了3D打印構(gòu)建物的彈性和塑性,，有效減輕了組織壓實(shí)和腫脹,。它表現(xiàn)出低剪切模量和快速交聯(lián)時(shí)間，同時(shí)具有較高的極限抗壓強(qiáng)度和抵抗細(xì)胞力及物理操作導(dǎo)致的變形能力,；這歸因于彈性顆粒的堆積和應(yīng)力消散,，這一點(diǎn)通過數(shù)學(xué)建模得到了證實(shí)。體內(nèi)植入研究表明,，含有POMaC顆粒的構(gòu)建物表現(xiàn)出更好的抵抗宿主組織應(yīng)力的能力,，增強(qiáng)了血管生成，并促進(jìn)了修復(fù)性巨噬細(xì)胞的浸潤,。相關(guān)工作以題為“Cell driven elastomeric particle packing in composite bioinks for engineering and implantation of stable 3D printed structures”的文章發(fā)表在2024年10月29日的期刊《Bioactive Materials》,。         

1.創(chuàng)新型研究內(nèi)容
本文提出了一種方法，該方法結(jié)合了生物水凝膠和彈性聚合物的優(yōu)點(diǎn),，形成了一種適用于立體光刻和擠出3D打印的復(fù)合顆粒生物墨水（圖1）,。通過將彈性微粒整合到生物源性水凝膠中，本文設(shè)計(jì)了一種生物墨水,，該墨水在自然水凝膠的支持下保持了細(xì)胞面對的生物學(xué)特性,，并且在高應(yīng)變下具有類似于聚合物彈性體的機(jī)械性能（圖1a）。這些彈性微粒是通過從檸檬酸,、馬來酸酐和1,8-辛二醇通過縮聚反應(yīng)合成的一種可紫外交聯(lián)的彈性體POMaC,，以批量和滴狀微流控方法生成的。這種與細(xì)胞兼容的彈性體之前已被用作心臟組織工程中的支架,，支持細(xì)胞生長,，并且允許創(chuàng)建體外器官芯片模型以及體內(nèi)植入的壓力傳感器。此外,，POMaC還被用來生產(chǎn)AngioChip,，這是一個(gè)促進(jìn)體外血管化的平臺(tái)。

【用于3D打印形態(tài)穩(wěn)定的復(fù)合顆粒材料】
研究人員在各種水凝膠中嵌入POMaC顆粒（特別是纖維蛋白,、GelMA和海藻酸鹽）創(chuàng)造了多功能的顆粒生物墨水,，這些墨水支持基質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的重塑和組織生成,，并增強(qiáng)血管形成,，同時(shí)添加熒光以用于構(gòu)建標(biāo)記（圖1a和b）。微機(jī)械壓縮測試結(jié)果表明,，復(fù)合材料在大范圍應(yīng)變下表現(xiàn)出與其母本水凝膠相似的行為（圖1b）,，這有助于擠出式3D打印。剪切壓縮測試顯示,，在低應(yīng)變下,，變形主要通過水凝膠組分傳遞，復(fù)合顆粒生物墨水表現(xiàn)出與其母本水凝膠幾乎相同的機(jī)械性能（圖1c）,。然而,，隨著壓縮剪切應(yīng)變增加，變形通過水凝膠傳遞,，使彈性顆粒相互接觸,，從而抵抗施加的變形（圖1c）。因此,，復(fù)合生物墨水在較高應(yīng)變下表現(xiàn)得像彈性固體,，最終表現(xiàn)出比其母本水凝膠顯著更高的極限抗拉強(qiáng)度（圖1c）,。有限元建模表明，當(dāng)結(jié)構(gòu)受到相同的壓縮位移時(shí),，與僅有的水凝膠相比,，復(fù)合材料內(nèi)的von Mises應(yīng)力降低（圖1d），進(jìn)一步支持了復(fù)合材料抵抗壓縮的能力,。這些雙模態(tài)機(jī)械性能使得顆粒復(fù)合材料在細(xì)胞培養(yǎng)和植入中表現(xiàn)出獨(dú)特的行為,。

圖1 復(fù)合水凝膠生物墨水中的彈性顆粒堆積用于穩(wěn)定3D打印結(jié)構(gòu)   

POMaC顆粒是通過將POMaC預(yù)聚物與聚乙二醇二甲基丙烯酸酯500（PEGDM）混合生成的，使用批量合成方法或微流控技術(shù)（圖2）,。對于批量合成,，本文采用懸浮聚合法，通過將POMaC聚合物注入到持續(xù)攪拌的PVA溶液中,。結(jié)果,，POMaC預(yù)聚物在被PVA溶液包裹后自發(fā)形成顆粒（圖2d）。這些顆粒隨后被過濾以分離出所需的尺寸,，并進(jìn)行UV交聯(lián)（圖2d）,。本文還采用了滴狀微流控技術(shù)作為生成單分散POMaC顆粒的概念驗(yàn)證（圖2ei）。本文使用了一個(gè)經(jīng)典的流動(dòng)聚焦接口在一個(gè)PDMS裝置中（圖2eii）,。為了抑制高粘度POMaC顆粒粘附和潤濕PDMS通道,，一個(gè)20號(hào)注射器針頭被側(cè)向插入PDMS芯片，與連續(xù)相通道相交,。顆粒被收集在管子里,，隨后在紫外光下進(jìn)行交聯(lián)（圖2ei）。

圖2 通過批量和微流控方法制備的POMaC顆粒的比較分析

【用于3D打印的混合POMaC顆粒和水凝膠生物墨水】

為開發(fā)一種既具有優(yōu)越機(jī)械穩(wěn)定性又同時(shí)保持細(xì)胞活性的3D打印生物墨水,，本文將POMaC顆粒與多種水凝膠進(jìn)行了整合,。這種生物墨水還可以添加細(xì)胞，并且與各種水凝膠兼容（圖3a）,。為確保粒子在水凝膠結(jié)構(gòu)中均勻分布,，在打印前必須充分混合粒子/水凝膠溶液。如果將粒子在試管中靜置幾分鐘而不受干擾,，它們往往會(huì)沉降,，這可能導(dǎo)致打印結(jié)構(gòu)的不一致性，或者在使用擠出打印時(shí)導(dǎo)致噴嘴堵塞,。首先,，本文通過比較包含大于100微米的顆粒和小于100微米的顆粒的PEGDA水凝膠結(jié)構(gòu)，研究了顆粒大小對打印性能的影響,。打印完成后,，對結(jié)構(gòu)進(jìn)行了成像，并量化了與原始設(shè)計(jì)的差異,。在所研究的條件下,，沒有顯著差異,，盡管觀察到較大顆粒和顆粒濃度降低時(shí)，差異有增加的趨勢,。掃描電子顯微鏡（SEM）分析GelMA/POMaC顆粒和GelMA對照的3D打印結(jié)構(gòu),，揭示了POMaC顆粒帶來的形態(tài)變化。觀察到它們的加入為水凝膠基質(zhì)引入了所需的紋理復(fù)雜性,，這可能有助于提高機(jī)械性能和細(xì)胞粘附特性（圖3b）。   

為擴(kuò)大富含POMaC顆粒的生物墨水的應(yīng)用范圍,，本文探索了它與不同3D打印模式的兼容性,。具體來說，本文進(jìn)行了立體光刻生物打印的試驗(yàn),，這種方法以其高分辨率和精確度而聞名（圖3ci-iii）,。此外，本文還研究了擠出打印,，這種方法具有多功能性和可擴(kuò)展性,，并且在材料多樣性方面也表現(xiàn)出色（圖3civ-vi）。本文的結(jié)果表明,，這種混合生物墨水促進(jìn)了復(fù)雜結(jié)構(gòu)的制造,，同時(shí)賦予結(jié)構(gòu)自熒光特性，可以在打印后用于成像和跟蹤（圖3d）,。此外,，本文還成功地展示了生物墨水與一系列水凝膠的打印能力，包括纖維蛋白,、藻酸鹽和GelMA（圖3e）,。

圖3 將POMaC顆粒整合到各種水凝膠中，以創(chuàng)建適用于多種3D打印應(yīng)用的混合生物墨水

【混合POMaC顆粒-水凝膠生物墨水增強(qiáng)了構(gòu)建物的機(jī)械特性】

本文將POMaC顆粒加入PEGDA水凝膠中,，與僅由PEGDA組成的對照組相比,，觀察到的膨脹程度有所減少。本文假設(shè)這種減少是由于嵌入在水凝膠基質(zhì)中的顆粒所賦予的阻力（圖4a–c）,。使用微機(jī)械測試儀測量楊氏模量顯示,，含有顆粒的混合3D打印海藻酸鹽構(gòu)建物的彈性顯著高于僅含海藻酸鹽的對照組（圖4d–f）。組織工程構(gòu)建物必須在細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)植入所需的操作步驟中保持其形狀并保持完整,，以最終保留其在體內(nèi)的功能,。本文的實(shí)驗(yàn)表明，將顆粒加入GelMA后進(jìn)行3D打印,，結(jié)果得到的構(gòu)建物較不易破碎（圖4g）,。壓縮測試（圖4h）證實(shí)了這一改進(jìn)，含有POMaC顆粒的構(gòu)建物表現(xiàn)出顯著更高的楊氏模量（圖4i）和更大的極限抗壓強(qiáng)度（圖4j）,。

圖4 在水凝膠中加入POMaC顆�,？梢栽黾悠錂C(jī)械穩(wěn)定性

【POMaC顆粒摻入3D打印的GelMA結(jié)構(gòu)中,，增強(qiáng)了心肌細(xì)胞的附著和收縮功能】

本文將人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）衍生的心肌細(xì)胞（CMs）接種到POMaC/GelMA 3D打印的結(jié)構(gòu)上，并監(jiān)測它們的發(fā)展,。這些細(xì)胞培養(yǎng)了10天,，在此期間它們被允許擴(kuò)展并表現(xiàn)出收縮活動(dòng)（圖5a）。肌鈣蛋白-T（TnT）染色表明心臟組織形成更加健壯,，這通過圖像分析工具進(jìn)一步量化（圖5b和ci）,。心臟功能也得到了評估，結(jié)果顯示含有顆粒的結(jié)構(gòu)有所改善,，表現(xiàn)為較低的興奮閾值（圖5cii）和增加的最大捕獲率（圖5ciii）,。此外，在1Hz刺激下,，含POMaC顆粒的結(jié)構(gòu)位移幅度更大（圖5civ和d）   

圖5 POMaC顆粒增強(qiáng)3D打印GelMA構(gòu)建物中心肌細(xì)胞的附著和收縮功能

【POMaC顆粒增強(qiáng)了復(fù)合構(gòu)建物中的體外血管穩(wěn)定性】

血管形成是組織工程策略成功的關(guān)鍵,。為此，本文將內(nèi)皮細(xì)胞和支持細(xì)胞（牙髓干細(xì)胞DPSC）一起播種到兩種不同的基質(zhì)中,，這兩種基質(zhì)都加入了彈性POMaC顆粒：GelMA和纖維蛋白（圖6a）,。在GelMA/POMaC顆粒構(gòu)建物中的血管形成得到了增強(qiáng)，血管直徑顯著更寬（圖6b和c）,。

圖6 POMaC顆粒對血管化組織構(gòu)建物中血管形成和穩(wěn)定性的影響

【POMaC顆粒增強(qiáng)了復(fù)合結(jié)構(gòu)中的血管生成和促再生巨噬細(xì)胞的招募】

為進(jìn)一步研究水凝膠支架的長期穩(wěn)定性,、結(jié)構(gòu)完整性和功能，本文將體內(nèi)的研究從最初的10天延長到2周和4周,。第2周時(shí)取出的支架的總體形態(tài)圖像顯示,，與不含顆粒的組相比，含有顆粒的支架顯示出更小的支架面積（圖7a和b）,。本文推測這是由于細(xì)胞浸潤增強(qiáng)和隨后的材料降解,，這在有顆粒存在的情況下更為顯著。含有顆粒和接種細(xì)胞（ECs/DPSCs）的組中明顯的證據(jù)表明,，在總體形態(tài)上支架內(nèi)血管化增加（圖7a）,。值得注意的是，盡管所有支架在解釋時(shí)都保持完整,，但組織學(xué)分析顯示,，缺乏顆粒的支架出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象，在沒有顆粒的支架中觀察到明顯的剪切和撕裂（圖7c和d）,，并且不含顆粒的組中殘留更多的水凝膠,。   

圖7 長期體內(nèi)植入帶有和不帶有細(xì)胞的POMaC顆粒/GelMA植入物

本文進(jìn)一步證明了含有POMaC顆粒的組中血管滲透顯著增加，通過CD31陽性染色量化（圖8a和b）,。此外,，本文研究了巨噬細(xì)胞浸潤到植入物中的情況，并觀察到在4周取出的樣本中顯著增加，通過CD68（總巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物）和CD206（一種親再生,、促血管生成的巨噬細(xì)胞滲入組織的標(biāo)志物）的染色顯示（圖8c-f）,。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了POMaC顆粒不僅在增強(qiáng)血管化和親再生巨噬細(xì)胞浸潤方面的關(guān)鍵作用，還在于保持支架的結(jié)構(gòu)完整性,，從而支持體內(nèi)組織整合和再生的長期過程,。

圖8 將POMaC顆粒加入GelMA構(gòu)建物中，可誘導(dǎo)植入物內(nèi)血管形成和促再生巨噬細(xì)胞浸潤

2.總結(jié)與展望
本文展示的技術(shù)是3D生物打印技術(shù)發(fā)展的一個(gè)有前景的途徑,，其提供了結(jié)構(gòu)保真度和生物功能之間的平衡,。復(fù)合墨水對各種打印方法和水凝膠的適應(yīng)性強(qiáng)調(diào)了POMaC顆粒混合生物墨水在滿足多種結(jié)構(gòu)和功能需求方面的潛力,，以推動(dòng)生物材料科學(xué),、組織工程和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用的發(fā)展。

文章來源：
https://www.sciencedirect.com/sc ... 24004523?via%3Dihub