3D打印介孔生物玻璃/PCL支架誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2表型極化,，并免疫調(diào)節(jié)BMSCs的成骨分化

來源：EngineeringForLife

生物陶瓷復(fù)合聚己內(nèi)酯（PCL）支架廣泛應(yīng)用于骨缺損修復(fù)研究。其中,，生物活性玻璃（BG）因其特有的無機(jī)非晶態(tài)結(jié)構(gòu),、生物活性及骨結(jié)合特性，被認(rèn)為是優(yōu)異的骨類修復(fù)材料。然而,，普通的BG和介孔BG孔道致密,、比表面積低限制了整體支架的機(jī)械性能和生物活性,，往往需要增大BG的比例來掩蓋這些缺點(diǎn),。3D打印可以依據(jù)骨的結(jié)構(gòu)以及骨缺損類型,，在成像數(shù)據(jù)和計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)模型的輔助下,，直接逐層制造高度精確的三維實(shí)體，廣泛應(yīng)用于骨組織工程,。聚合物和生物陶瓷的3D打印可以極大的滿足支架的性能要求,，是目前研究的熱點(diǎn),。

廣東省科學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所許為康團(tuán)隊(duì)和遵義醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院瓦慶德團(tuán)隊(duì)制備出高比表面積和孔徑的樹枝狀介孔結(jié)構(gòu)生物活性玻璃（MBG）,。將不同比例的MBG粉末與PCL混合,，應(yīng)用3D 打印機(jī)制備MBG/PCL支架。對復(fù)合支架進(jìn)行理化性能和免疫協(xié)調(diào)成骨性能研究,，從而優(yōu)選具備最佳抗壓強(qiáng)度和成骨活性的MBG比例支架,。最后,，依據(jù)最佳MBG比例制備出不同纖維直徑和孔徑的MBG/PCL支架，探索纖維粗細(xì)和孔徑在支架理化性能和調(diào)控巨噬細(xì)胞（MP）向M2表型極化并促進(jìn)成骨潛能上的影響,。   

1,、主要內(nèi)容

圖1 MBG的表征

MBG是由許多納米級別的小顆粒堆積組合形成的微球,，玻璃微球分散性好,，表面疏松多孔,，孔道呈樹枝狀分布,。MBG的N2吸附脫附曲線符合介孔材料的IV型等溫線，經(jīng)過計(jì)算可得出生物活性玻璃微球的比表面積為457.14m2/g,，孔體積為1.38cm3/g，平均孔徑為11.83nm,。

圖2 MBG/PCL支架的表面形貌及接觸角

各組支架絲徑粗細(xì)均勻,，纖維方向相差90°相互交錯(cuò)。支架表面存在散在孔隙,，5MBG/PCL、10MBG/PCL、20MBG/PCL,、30MBG/PCL支架表面可見MBG顆粒附著,。從高倍鏡下看,，支架表面的粗糙度隨著MBG含量的增加而增加,，以30MBG/PCL最為顯著。這些粗糙面可以為細(xì)胞提供粘附的位點(diǎn),，更有利于引導(dǎo)細(xì)胞增殖,、分化等行為。此外,，MBG的加入改善了PCL材料的親水性,，其改善程度與MBG濃度相關(guān)。   

圖3 MBG/PCL支架的理化特性

各組支架均出現(xiàn)PCL的特征峰,，其中2850-3000cm-1處–(CH2)4–為CH伸縮振動(dòng),，1750cm-1處是C=O伸縮振動(dòng)峰，1150-1250cm-1代表-C-O-,。隨著MBG含量的增加,，PCL原有的特征峰逐步降低。通過對各組支架進(jìn)行熱重分析,，支架剩余無機(jī)顆粒的質(zhì)量與混入MBG的比例基本一致。在支架的抗壓縮性能測試中,，我們可以看到隨著MBG含量的增加PCL的抗壓能力逐漸增強(qiáng),。以10%最顯著。但在此基礎(chǔ)上,，隨著MBG含量的增加支架的抗壓強(qiáng)度逐步下降,。20%和30%支架在達(dá)到抗壓峰值后迅速坍塌。這是因?yàn)镻CL包裹MBG顆粒類似于“海-島”結(jié)構(gòu),。我們推測,，當(dāng)MBG（“島”組分）含量進(jìn)一步增大時(shí)，對PCL（“�,！苯M分）的整體連接性能產(chǎn)生了不利的影響,，進(jìn)而降低支架的最大抗壓強(qiáng)度。同時(shí),，較大比例的MBG在PCL中團(tuán)聚,，使得抗壓形變過程中受力不均導(dǎo)致支架整體坍塌,。   

圖4 MBG/PCL支架的細(xì)胞相容性和成骨性能

BMSCs在各組支架上增殖的OD值隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，10MBG/PCL組增殖活性顯著優(yōu)于其他組,。在成骨分化早期,，5MBG/PCL、10MBG/PCL,、20MBG/PCL,、組成骨基因（ALP、OPN,、BMP2）的表達(dá)量顯著高于0MBG/PCL組,，而30MBG/PCL與0MBG/PCL組差異不顯著。在COLI的表達(dá)中則是含MBG的支架顯著高于純PCL組,。值得注意的是,，相比其他組，10MBG/PCL組支架在上述基因的表達(dá)上調(diào)中最為顯著,。在RUNX2的表達(dá)中,，10MBG/PCL組同樣顯著高于0MBG/PCL和5MBG/PCL組，而與20MBG/PCL,、30MBG/PCL無顯著差異,。成骨誘導(dǎo)14天后，相比其他組,，10MBG/PCL組仍最顯著地上調(diào)OPN,、RUNX2、BMP2,、COLI的表達(dá),。在ALP表達(dá)中，10MBG/PCL和20MBG/PCL顯著優(yōu)于0MBG/PCL組,，同時(shí)10MBG/PCL＞30MBG/PCL,，而其余各組之間卻無顯著差異。將BMSCs與支架共培養(yǎng),，成骨誘導(dǎo)7天進(jìn)行ALP定量分析,，10MBG/PCL組支架ALP表達(dá)量最高，而其余各組之間差異不顯著,，這也與ALP染色的結(jié)果一致,。綜上所述，在PCL材料中摻入MBG,，可以增強(qiáng)其體外成骨性能,，其中以10MBG/PCL支架的促BMSCs成骨分化性能最為優(yōu)異。研究表明,，BG釋放的Si2+,、Ca2+,、P5+離子在與BMSCs等細(xì)胞接觸過程中會調(diào)控細(xì)胞周期并上調(diào)或激活成骨基因的表達(dá)，且納米尺寸的BG具備更強(qiáng)的生物活性,，尺寸較小的生物玻璃促使細(xì)胞由G0/G1期向S/G2期能力更強(qiáng),，而尺寸大的生物玻璃使得更大比例的細(xì)胞保持在G0/G1期。這可能是含量20%,、30%MBG支架增殖活性顯示較低的原因（MBG在PCL表面團(tuán)聚）,。

圖5 MBG/PCL支架的免疫調(diào)控性能

10MBG/PCL支架上調(diào)巨噬細(xì)胞M2型基因（CD206、ARG）表達(dá)以及抑制M1型基因（TNF-α,、IL-1β）表達(dá)的性能最顯著,。相比與純PCL支架，MBG賦予了PCL一定的促M(fèi)P向M2表型極化的能力,。為了評價(jià)支架介導(dǎo)MP的M2極化促進(jìn)BMSCs成骨分化的潛能,，在各組支架中加入相應(yīng)的MP條件培養(yǎng)基進(jìn)行促BMSCs成骨分化研究。MP條件培養(yǎng)基下10MBG/PCL組上調(diào)成骨相關(guān)基因（ALP,、RUNX2,、OPN、COLI,、BMP-2）的表達(dá)最顯著,，ALP染色和定量同樣如此。我們推測這與MBG的劑量相關(guān),，更高濃度的MBG可能會延長MP向M1極化的過程,，表達(dá)更多的M1表型基因TNF-α和IL-1β，不利于炎癥的清除,。

圖6 F300,、F500、F800表面形貌和理化性能

以10MBG/PCL支架為模板設(shè)定3D打印參數(shù),。打印統(tǒng)一孔徑500um,，不同纖維直徑（300um、500um,、800um）的三組支架,，分別標(biāo)記為F300,、F500,、F800。支架的親水性和抗壓強(qiáng)度以F500最佳,。當(dāng)纖維直徑減少200um,，支架的抗壓性能則降低15.72MPa。纖維直徑增加300um,，支架的抗壓性能則上升4.28MPa,。更粗的纖維增加了支架的受力面積,，因此整體表現(xiàn)為支架的抗壓能力隨著纖維的增粗而增強(qiáng)。三組支架的孔隙率則與抗壓性能相反,，相比F500,，F(xiàn)300的孔隙率增加1.73%，而F800則下調(diào)了6.06%,。  

圖7 P200,、P500、P800表面形貌和理化性能圖片

打印統(tǒng)一纖維直徑500um,，不同孔徑（200um,、500um、800um）的支架,，分別標(biāo)記為P200,、P500、P800,。P500的接觸角最大,，而P200和P800的接觸角無顯著差異。支架的孔徑越大孔隙率越高,，同時(shí),，支架的抗壓強(qiáng)度隨著孔徑增大而下降。這可能是孔徑的增寬降低了支架的受力面積,，進(jìn)而導(dǎo)致抗壓能力的減弱,。   

圖8 F300、F500,、F800細(xì)胞增殖活性和成骨性能

BMSCs能在不同纖維直徑支架上定植,，其中F500的熒光數(shù)量最多，其次為F800,，這與細(xì)胞增殖的OD值梯度相符,。這是由于纖維越細(xì)單位面積內(nèi)絲徑數(shù)目越多，能為細(xì)胞提供更多的粘附位點(diǎn),。但是,，由于F300相對弧度較大，反而最不利于細(xì)胞早期粘附,。細(xì)胞粘附的差異同樣反應(yīng)在成骨性能上,，F(xiàn)500上調(diào)成骨基因（ALP、RUNX2,、OPN,、COLI、BMP-2）的表達(dá)最為顯著，F(xiàn)300次之,，最低的是F800,。然而，在ALP染色和定量中雖然仍以F500最佳,，但是F800,、F300卻無顯著差異。

圖9 F300,、F500,、F800促RAW264.7細(xì)胞極化和免疫調(diào)控成骨性能

在炎癥基因的表達(dá)中，較粗的纖維和較大的孔徑似乎更有利于細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和沉積,，傾向于修復(fù)表型M2基因（CD206,、ARG）的表達(dá)。F500顯著抑制了M1型基因（TNF-α,、IL-1β）的表達(dá),，F(xiàn)300卻顯著上調(diào)M1型基因，然而在第3天的TNF-α表達(dá)中F800＞F300,。然而,，F(xiàn)300誘導(dǎo)MP極化為M2的性能要優(yōu)于F800，這可能是同等面積下,，F(xiàn)300的纖維交叉較多,，有利于MP的拉伸，促進(jìn)M2極化,。在MP條件培養(yǎng)基的介導(dǎo)下,，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，F(xiàn)500促進(jìn)成骨基因（ALP,、OPN,、BMP-2、COLI）的表達(dá)上調(diào)最為顯著,。在RUNX2的表達(dá)中,，第7天F500顯著高于F800，與F300無顯著差異,。第14天,，F(xiàn)300優(yōu)于F800，但F500與其余兩組未表現(xiàn)出差異,。F300和F800在ALP的染色和定量中未出現(xiàn)顯著差異,，F(xiàn)500能顯著的促進(jìn)ALP分泌�,？偟膩碚f,，在免疫調(diào)控成骨性能上，F(xiàn)500>F300>F800,。

圖10 P200,、P500、P800細(xì)胞增殖活性和成骨性能

將支架與BMSCs共培養(yǎng),，在第1天的增殖中,，P800的OD最高，P200與P500無顯著差異,。而在3,、7天，P500的細(xì)胞增殖活性顯著上調(diào),�,？傮w上，BMSCs的增殖活性P500>P800>P200,。在共培養(yǎng)三天后的熒光染色中,，我們同樣可以看到這樣的趨勢。在第7天的ALP染色和定量中,，我們可以看到P500具有最顯著的ALP表達(dá)效果,。在成骨基因ALP、OPN,、RUNX2,、BMP-2、COLI的表達(dá)中,，P500的上調(diào)性能最顯著,。較小的孔徑不利于成骨組織表型的功能分化，足夠大（＞250um）的孔徑利于骨的礦化,。而P500具備最顯著的成骨潛能,，這可能是纖維直徑500um、孔徑500um的支架處于理化性能,、細(xì)胞粘附和營養(yǎng)物質(zhì)交換之間最佳的平衡狀態(tài),。   

圖11 P200、P500,、P800促RAW264.7細(xì)胞極化和免疫調(diào)控成骨性能

如圖11所示,，大孔徑似乎更能促進(jìn)MP向M2表型極化。相比P300,，P500和P800顯著上調(diào)CD206和ARG的表達(dá),，同時(shí)，第一天的ARG表達(dá)P500＞P800,，而其他情況下P500和P800無顯著差異,。P200誘導(dǎo)炎癥基因（TNF-α、IL-1β）的表達(dá)最顯著，P800次之,，P500顯示出顯著的抑制效果,。P200和P800促M(fèi)P極化的能力弱于P500，這可能也是支架性能和細(xì)胞滲透未達(dá)到最佳平衡所致,。在MP條件培養(yǎng)基的介導(dǎo)下,，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，P500顯著上調(diào)成骨基因的表達(dá),，P800的體外免疫成骨性能要優(yōu)于P200,。同樣的，在ALP的染色和定量中,，P500表現(xiàn)最顯著的活性,。   

2、總結(jié)與展望
我們合成了高活性的MBG,，提升了PCL支架整體的抗壓性能和生物活性,。其中10MBG/PCL具備最高的抗壓強(qiáng)度（約是純PCL支架的2倍）和最優(yōu)異的體外誘導(dǎo)成骨活性。10MBG/PCL支架顯著的抑制了MP的M1表型極化過程,，上調(diào)M2抗炎表型基因,。進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)，支架的理化性能和成骨活性同時(shí)受纖維粗細(xì)和孔徑大小的影響,。然而,，支架的孔徑大小比纖維粗細(xì)更能誘導(dǎo)MP的極化�,？傊�,，纖維直徑500um、孔徑500um的10MBG/PCL支架具備最佳的成骨潛能,，能顯著誘導(dǎo)MP向M2表型極化,，且該組最能介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化進(jìn)而誘導(dǎo)BMSCs成骨分化，形成利于骨再生的免疫微環(huán)境,。本研究向BG復(fù)合PCL支架性能的探索邁進(jìn)了一步,，為骨移植材料的研發(fā)提供了新的思路。

參考資料：https://doi.org/10.36922/ijb.3551