大尺寸血管化組織的同軸生物3D打印方法

來源： EngineeringForLife

組織/器官內(nèi)的血供系統(tǒng),，為組織提供了必須的營養(yǎng)及代謝交換。而組織體外重建時(shí)當(dāng)尺寸>200μm時(shí),，就會超出營養(yǎng)/氧氣的擴(kuò)散極限,，需要構(gòu)造豐富的血管系統(tǒng),，避免內(nèi)部營養(yǎng)輸送不暢。

2015年,，我們提出組織+營養(yǎng)通道一次性制造的同軸生物打印方法（Biomaterials, 2015,，61, 203-215），用來制造帶有營養(yǎng)流道的大尺寸結(jié)構(gòu),，如圖1所示,。其基本原理是：將交聯(lián)劑/水凝膠材料分別通入同軸噴頭的內(nèi)/外通道，交聯(lián)劑和水凝膠在噴嘴出口處相遇,，水凝膠發(fā)生快速交聯(lián)形成中空凝膠管,，再將凝膠管通過層層沉積形成帶有流道的三維結(jié)構(gòu)。然而,，當(dāng)時(shí)采用灌流內(nèi)皮細(xì)胞懸液進(jìn)行了血管化嘗試,，效果不佳，因?yàn)楣嗔鲀?nèi)皮細(xì)胞懸液的方式只能實(shí)現(xiàn)簡單結(jié)構(gòu)的血管化,，故而15年的工作重點(diǎn)聚焦在提升大尺寸組織的營養(yǎng)輸送效率,。

圖1 同軸打印血管通道

16年我們開始探索如何深化，19年我們通過耦合犧牲打印和同軸打印工藝,，提出組織/血管同軸3D打印思路,，以實(shí)現(xiàn)血管+結(jié)構(gòu)同步制造（圖2）。通過設(shè)計(jì)核/殼型的GelMA/明膠墨水,，利用同軸噴頭將載組織細(xì)胞墨水(外噴頭)和載內(nèi)皮細(xì)胞犧牲墨水(內(nèi)噴頭)同時(shí)擠出,，打印時(shí)犧牲墨水支撐流道，培養(yǎng)時(shí)犧牲墨水融化形成通暢的流道網(wǎng)絡(luò),，同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞從犧牲墨水中釋放,，粘附于流道內(nèi)壁進(jìn)行血管化，實(shí)現(xiàn)從流道網(wǎng)絡(luò)到血管化網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)變,�,；�于此方法，��(shí)現(xiàn)了血管化大塊組織結(jié)構(gòu)（≥1 cm）的打印及體外長時(shí)間培養(yǎng)（≥20 days）,，并成功將其應(yīng)用于血管化的腫瘤模型和骨組織的制造。

圖2 血管+結(jié)構(gòu)一次性打印原理

此外,，在血管+結(jié)構(gòu)的一次性打印策略中,，由于載細(xì)胞墨水和犧牲墨水相互協(xié)同作用，相互增強(qiáng)了各自的可打印性,，能夠容易的實(shí)現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)的打印,。同時(shí)，由于實(shí)體結(jié)構(gòu)的自支撐效應(yīng),，可打印具有較高保證度的三維復(fù)雜結(jié)構(gòu),，且在結(jié)構(gòu)內(nèi)的血管流道保持的較好（圖3）,。

圖3 三維復(fù)雜血管流道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)打印

為了模擬生物體內(nèi)細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)組成多樣性，我們還模擬制造了多細(xì)胞或多材料組織結(jié)構(gòu)（圖4,、圖5）,，采用多合一噴頭裝置，可以切換多種載細(xì)胞材料與犧牲材料進(jìn)行同步打印,。打印時(shí),，選擇性的通入目標(biāo)載細(xì)胞材料，同時(shí)通入犧牲材料,，可以打印出含有血管流道的多組分組織結(jié)構(gòu)體,。

圖4 多組分血管流道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)打印原理

圖5 多組分血管流道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

為了驗(yàn)證血管流道網(wǎng)絡(luò)輸送營養(yǎng)/氧氣的有效性，,，我們打印了cm級的含血管流道網(wǎng)絡(luò)的大塊載細(xì)胞結(jié)構(gòu)體(10 mm × 10 mm × 10 mm),，并觀察結(jié)構(gòu)體不同部位的細(xì)胞生長狀況（圖6），細(xì)胞在整個(gè)流道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)均可逐漸伸展,、遷移并連接,，驗(yàn)證了流道網(wǎng)絡(luò)的傳輸營養(yǎng)/氧氣的有效性。

圖6 培養(yǎng)第6天時(shí),，乳腺癌細(xì)胞在結(jié)構(gòu)內(nèi)逐漸伸展并連接

隨后我們驗(yàn)證了通過內(nèi)皮細(xì)胞自動沉積生成血管化通道的可行性,，經(jīng)驗(yàn)證內(nèi)皮細(xì)胞可以自沉積并粘附到血管流道內(nèi)壁，并隨著體外培養(yǎng)而增殖,，最終覆蓋并內(nèi)皮化流道網(wǎng)絡(luò),，形成功能化的內(nèi)皮管腔。（圖7）,。

圖7 內(nèi)皮細(xì)胞自動沉積,，可以有效的無死區(qū)的內(nèi)皮化流道，同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞在流道內(nèi)增殖,、伸展連接形成功能化的內(nèi)皮管腔

最后基于血管+結(jié)構(gòu)一次性打印策略,，我們打印了血管化的腫瘤組織，癌細(xì)胞在血管化組織結(jié)構(gòu)內(nèi)伸展,，連接,，同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋并內(nèi)皮化流道網(wǎng)絡(luò)，最終形成功能化的血管化腫瘤組織（圖8）,。

圖8 血管化腫瘤組織

與此同時(shí),，隨著長時(shí)間的培養(yǎng)，內(nèi)皮細(xì)胞會產(chǎn)生血管新生芽朝向腫瘤組織內(nèi)部生長（圖9）,，而且癌細(xì)胞會逐漸向血管流道方向遷移（圖10）,。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明打印的血管化組織具有相應(yīng)的生物功能，模擬出了腫瘤組織的血管化,、遷移和侵襲等特性,。

圖9 血管出芽

圖10 癌細(xì)胞遷移

最后,，我們還打印血管化骨組織（圖11），再次驗(yàn)證血管化大組織打印策略的有效性,，血管+結(jié)構(gòu)一次性打印方法突破了大塊組織的體外制造瓶頸,。

圖11 血管化骨組織

血管+結(jié)構(gòu)一次性打印方法簡單實(shí)用，可有效的,，無死區(qū)的使復(fù)雜血管流道網(wǎng)絡(luò)血管化,，促進(jìn)了細(xì)胞的存活、伸展,、遷移,、連接及血管化組織的新生。同時(shí)載細(xì)胞墨水和犧牲墨水同軸打印自支撐實(shí)體結(jié)構(gòu),，使得復(fù)雜結(jié)構(gòu)的制造更加容易,。而且，采用多合一噴頭,，可實(shí)現(xiàn)多組分血管流道結(jié)構(gòu)的打印,，使得多細(xì)胞或多細(xì)胞外基質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)制造成為可能。此外,，打印的血管流道結(jié)構(gòu)后續(xù)可通過灌流培養(yǎng),，進(jìn)行實(shí)時(shí)灌流下的血管化組織發(fā)育成熟過程研究。血管+結(jié)構(gòu)一次性打印方法特別擅長于大尺寸組織的體外重建,。

相關(guān)論文“Directly Coaxial 3D Bioprinting of Large-scale Vascularized Tissue Constructs”近日刊登在Biofabrication雜志上,。第一作者為邵磊博士生，通訊作者為賀永教授,，傅建中教授,、高慶博士后為共同通訊。

論文地址：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/ab7e76