加州大學(xué)生物3D打印GelMA基血管化皮膚

來源： EngineeringForLife

皮膚提供了一種生理屏障,，可以保護內(nèi)臟免受溫度變化、機械沖擊,、各種微生物和化學(xué)物質(zhì)的影響,。它由三個主要成分組成:表皮，真皮和皮下組織,。(1)表皮含有4 ~ 5層上皮細胞,，可形成角質(zhì)化的復(fù)層鱗狀上皮；(2)真皮由真皮成纖維細胞(DFs)產(chǎn)生的膠原和彈性蛋白纖維相互連接的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，真皮內(nèi)的血液和淋巴管為皮膚提供營養(yǎng),，并與真皮成纖維細胞相互作用,；(3)皮下組織血管分布良好，主要由脂肪,、血管和神經(jīng)組成,。這些不同的皮層提供了獨特的微環(huán)境，其中每一層都可以直接或間接地與其他層溝通,，從而實現(xiàn)其特殊功能,。因此，擁有一個可復(fù)制的皮膚組織模型不僅有助于可靠地預(yù)測人類皮膚的功能反應(yīng),，而且有可能在不久的將來開發(fā)出個性化的皮膚相關(guān)疾病模型,。

近期，加州大學(xué)的Ali Khademhosseini教授團隊在Biofabrication雜志上發(fā)表的題為“Biofabrication of endothelial cell, dermal fibroblast, and multilayered keratinocyte layers for skin tissue engineering”的文章,，作者使用基于生物醫(yī)學(xué)的方法和生物工程技術(shù)開發(fā)了一個具有內(nèi)皮細胞網(wǎng)絡(luò),、真皮成纖維細胞和多層角質(zhì)細胞的三維皮膚組織模型。

作者提出構(gòu)建三維皮膚組織模型的思路：(1)在具有0.4μm孔徑的聚酯多孔膜上打印載有HUVECs的GelMA/海藻酸鹽水凝膠,，該結(jié)構(gòu)有利于真皮成纖維細胞與內(nèi)皮細胞的相互作用以及促進營養(yǎng)物的擴散(形成內(nèi)部血管網(wǎng)絡(luò)),；(2)打印封裝有人真皮成纖維細胞的GelMA水凝膠，通過調(diào)節(jié)基質(zhì)硬度影響細胞的生長和功能,；(3)通過多次在真皮層上方鋪覆包裹有角質(zhì)細胞的明膠形成多層的表皮明膠涂層,。

圖1 皮膚組織每層結(jié)構(gòu)的示意圖

為了實現(xiàn)上述構(gòu)想，作者首先將具有生物相容性的GelMA/海藻酸鹽水凝膠混合HUVECs并3D打印到多孔膜上,，并檢測生物墨水的可打印性,、凝膠性和對細胞活力的影響，并確定了合適的GelMA/海藻酸鹽水凝膠配比,。

圖2 3D打印內(nèi)皮細胞層

然后，在室溫下通過流變性測試和模量測試測量光交聯(lián)前后不同生物墨水的粘度和壓縮模量,。實驗結(jié)果表明,，隨著海藻酸鹽濃度的增加，交聯(lián)生物墨水的流變性能和壓縮模量變大,。隨后,，為了檢驗3D生物墨水的生物相容性，在培養(yǎng)的第1,、4,、7天對HUVECs的存活率進行了評估。細胞培養(yǎng)在柔軟的水凝膠中時表現(xiàn)出了更高水平的生存能力,�,；�于上述結(jié)果，7.5% GelMA/2%海藻酸配方被選為HUVECs生物打印的生物墨水,。

圖3 GelMA基水凝膠的粘性,、壓縮模量和生物兼容性測試

由于基質(zhì)硬度在調(diào)節(jié)細胞功能中起著關(guān)鍵作用,，作者分別評估了5%、7.5%和10% GelMA水凝膠的流變性能,、壓縮模量和人真皮成纖維細胞的生存能力,，以確定設(shè)計真皮層的最佳凝膠濃度。結(jié)果表明,，凝膠的流變模量和壓縮模量隨著凝膠濃度的增加而增加,，而無論凝膠的濃度如何均顯示出良好的生物相容性。

圖4 機械性能可調(diào)節(jié)的GelMA水凝膠用于構(gòu)建3D真皮層

之后,，作者發(fā)現(xiàn)在濃度為7.5%的GelMA水凝膠中人真皮成纖維細胞具有更高的增殖和擴散能力,。此外，在濃度為7.5%的GelMA水凝膠中人真皮成纖維細胞具有更高的I型膠原酶原的分泌能力和更低的I型金屬蛋白酶的分泌能力,，表明該環(huán)境下人真皮成纖維細胞能形成更具有彈性和強度的皮膚組織,。

圖5 真皮層細胞活性及功能鑒定

最后，作者將人角質(zhì)細胞接種于真皮層上,，然后將含1%的生長培養(yǎng)基的明膠覆蓋在角質(zhì)細胞上并重復(fù)多次,。結(jié)果表明，每層的人角質(zhì)細胞都具有很高的存活能力,，通過該方法可以在短時間內(nèi)簡單地得到約137μm厚的表皮層,。

圖6 多層角質(zhì)細胞構(gòu)建表皮層

為了可視化皮膚模型中不同的細胞層，作者在細胞播種前分別用藍,、紅,、綠對HUVECs、人真皮成纖維細胞和人角質(zhì)細胞進行了標(biāo)記,。橫切面圖像顯示,，構(gòu)建的皮膚組織在每一層表現(xiàn)出良好的層次結(jié)構(gòu)。在本研究中,，作者提供了一種簡單的方法,，利用生物醫(yī)學(xué)方法和生物工程技術(shù)來優(yōu)化皮膚組織的每一層。構(gòu)建出的3D皮膚組織作為一個多功能平臺,，使體外皮膚模型的重建成為可能,。

圖7 3D生物制造皮膚組織模型