AM 細(xì)胞外基質(zhì)增強(qiáng)型生物墨水用于人體組織的3D打印

來源： EngineeringForLife

3D生物打印技術(shù)主要是用生物材料和活體細(xì)胞，模擬體內(nèi)器官結(jié)構(gòu),，通過3D打印的形式將器官打印出來,，該技術(shù)有望成為未來器官移植的重要手段。但迄今為止,，3D生物打印的研究大多局限于構(gòu)造結(jié)構(gòu)簡單的組織,，如皮膚和心肌補(bǔ)片,。目前，研究人員已經(jīng)探索了幾種提高生物墨水生物活性的技術(shù),，如結(jié)合特定配體及對材料表面進(jìn)行功能化修飾以增強(qiáng)細(xì)胞粘附或血管生成等,。然而，這些手段通常專注于增強(qiáng)組織發(fā)育某一階段的生物活性(例如,，細(xì)胞粘附或促血管形成等),。

脫細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)(dECM)來源于天然組織，是一種潛在的具有組織特異性成分的生物墨水,。然而細(xì)胞外基質(zhì)較差的凝膠動力學(xué)特性限制了其3D生物打印的精度,，為了克服單一細(xì)胞外基質(zhì)生物墨水的局限性，瑞典隆德大學(xué)瓦倫堡分子醫(yī)學(xué)中心Nathaniel S.Hwang研究團(tuán)隊在Advanced Materials上發(fā)表題為“Extracellular-Matrix-Reinforced Bioinks for 3D Bioprinting Human Tissue”的文章,。研究者制備了一種組織特異性復(fù)合生物墨水,，它由天然聚合物海藻酸鹽組成，并用脫細(xì)胞化的細(xì)胞外基質(zhì)（dECM）增強(qiáng)生物活性,，該復(fù)合生物墨水可用于構(gòu)建具有一定尺度的無需外部支撐結(jié)構(gòu)的可灌注管狀和分支結(jié)構(gòu),。此外，該復(fù)合生物墨水中的ECM增強(qiáng)了3D生物打印過程中原代人祖細(xì)胞的存活,，支持組織特異性細(xì)胞分化,，并在體內(nèi)刺激植入物的全層血管化，同時最大限度地減少異體反應(yīng),。

由于ECM組分的自發(fā)自組裝,，從胃蛋白酶消化脫細(xì)胞組織得到的ECM溶液在37°C時可形成凝膠，因此需要一個支撐結(jié)構(gòu)來使用3D打印形成更復(fù)雜的幾何形狀,。海藻酸鈉對哺乳類動物細(xì)胞是無毒且具備生物惰性的,，研究者通選用海藻酸鈉通過微相分離制備得到具有互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、相分離的復(fù)合ECM衍生水凝膠（rECM）,。通過分別對ECM和海藻酸鈉進(jìn)行熒光標(biāo)記,，研究者發(fā)現(xiàn)ECM組分均勻分布于凝膠塊體中，且保留了微觀的相分離結(jié)構(gòu),。對比海藻酸鈉水凝膠,，ECM復(fù)合的水凝膠增強(qiáng)了剪切應(yīng)力下的機(jī)械強(qiáng)度。細(xì)胞生物學(xué)評價表明小鼠肺上皮細(xì)胞（MLE12）及人肺上皮細(xì)胞（A549）均能在海藻酸鈉凝膠和ECM復(fù)合水凝膠中實現(xiàn)良好的增殖效果,，通過5-乙炔-2′-脫氧尿苷（EdU）染色,，探究rECM水凝膠中MLE12的增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測數(shù)據(jù)表明ECM成分具有較高的生物活性并能誘導(dǎo)其增殖（圖1）,。

圖1 rECM復(fù)合水凝膠的力學(xué)及細(xì)胞相容性表征

促血管生成的3D打印結(jié)構(gòu)有利于移植物的長期存活,，研究者利用雞胚絨毛尿囊膜實驗評價凝膠的體外成血管能力，研究發(fā)現(xiàn),，相比基底膜提取物（BME）組,，rECM凝膠組明顯促進(jìn)了新血管生成,。體內(nèi)凝膠的皮下植入試驗結(jié)果表明，rECM復(fù)合水凝膠減少了促炎癥M1巨噬細(xì)胞的增加,，也表明了抑制M1表型對組織再生的重要性,，且rECM水凝膠支架中含有完整的新生血管網(wǎng)絡(luò)（圖2）。

圖2 rECM復(fù)合水凝膠的血管生成性能表征

為了驗證rECM生物墨水是否具有生成生物組織的潛能,，研究者測試了來自肺組織ECM的rECM復(fù)合水凝膠是否能夠支持從正常人呼吸道分離的原代上皮祖細(xì)胞的生長和分化,。研究者將人類支氣管上皮細(xì)胞（HBECs）接種于凝膠表面，培養(yǎng)7天形成單層細(xì)胞層,，之后提起至氣液界面,，模擬體內(nèi)的組織環(huán)境，孵育培養(yǎng)一個月,。熒光染色表明細(xì)胞粘附生長于凝膠表明,，形成多層上皮層,，且上皮細(xì)胞保留了基底祖細(xì)胞表型標(biāo)志物的表達(dá),。在證實了人類rECM生物墨水具有優(yōu)異的流變學(xué)和生物學(xué)屬性后，研究者測試了其3D生物打印亞段支氣管的能力,，亞段支氣管直徑約為4mm,，由外平滑肌層和內(nèi)上皮層組成。所打印的支氣管結(jié)構(gòu)包含三層細(xì)胞,，內(nèi)層是HBECs細(xì)胞層,，外部兩層是人肺平滑肌細(xì)胞（HLSMCs）細(xì)胞層。經(jīng)過7天的培養(yǎng)基液體環(huán)境中培養(yǎng)和氣-液界面環(huán)境下的28天孵育后,，3D生物打印人體氣管的內(nèi)腔均保持開放狀態(tài),，沒有明顯的尺寸變化，這表明該結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定時間至少可達(dá)28天,。

圖3 rECM復(fù)合水凝膠用于呼吸道組織的構(gòu)建

綜上所述,，復(fù)合ECM組分，研究者通過微相分離產(chǎn)生了dECM增強(qiáng)性的的組織特異性rECM水凝膠,，該類生物墨水能在體外3D生物打印出人類呼吸道上皮祖細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞組成的氣管空腔結(jié)構(gòu),。該研究為下一代組織特異性生物墨水的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)，并使3D生物打印組織應(yīng)用于臨床移植成為可能,。