Nature 子刊：高密度細胞球懸浮打印構(gòu)建異質(zhì)組織

來源：EngineeringForLife

我們需要細胞模型在體外研究人類發(fā)育和疾病,，以及篩選藥物的毒性和功效,。目前的研究方法在功能化組織模型的構(gòu)建方面受到限制,，這樣的模型需滿足必要的細胞密度和異質(zhì)性，以適當?shù)啬�擬細胞和組織行為,。在此,，研究者開發(fā)了一種生物打印方法，以高分辨率將球體轉(zhuǎn)移到自愈合支撐水凝膠中,，從而使其圖案化并按預先設(shè)定的空間位置融合到高細胞密度的微組織中,。研究者生物打印了誘導多功能干細胞來源的心臟微組織模型，該微組織有著空間上可控,、且成比例的心肌細胞和成纖維細胞,，以模擬心肌梗死后引發(fā)的疤痕性心臟組織的結(jié)構(gòu)和功能特性，包括收縮力減弱和不規(guī)律的電活動,。生物打印體外模型與功能讀數(shù)相結(jié)合,，以探究各種促再生microRNA治療方案如何影響由心肌細胞增殖帶來的組織再生和功能恢復。該方法適用于一系列生物醫(yī)學應(yīng)用,，包括開發(fā)精確模型來模擬疾病和篩選藥物,，尤其是在高細胞密度和異質(zhì)性很重要的情況下。

相關(guān)研究以題為“3D bioprinting of high cell-density heterogeneous tissue models through spheroid fusion within self-healing hydrogels”發(fā)表于“Nature Communications”雜志,，賓夕法尼亞大學的Jason A.Burdick教授為通訊作者,，Andrew C. Daly為第一作者。

為了能實現(xiàn)球體的圖案化,，研究者開發(fā)了一種在自愈合水凝膠中生物打印球體的方法：1. 真空抽吸介質(zhì)儲器中的球狀體,；2. 將球體直接轉(zhuǎn)移至有剪切變稀特性的支撐水凝膠中；3. 由真空去除和水凝膠自愈合,，將球體沉積到任意位置,，如圖1a所示。這一過程是通過在兩個容器之間的用于球體輸送的狹窄通道將包含球體的培養(yǎng)基容器與包含支撐水凝膠的第二容器分離,，如Movie 1所示,。該方法避免了在液體和空氣界面之間轉(zhuǎn)移細胞和球體時，表面張力效應(yīng)會顯著降低細胞活力,。支撐浴水凝膠由用金剛烷或β-環(huán)糊精修飾的透明質(zhì)酸組成,，具有剪切變稀和自愈合的特性，在高應(yīng)變到低應(yīng)變的循環(huán)過程中,，隨著剪切速率的增加,，水凝膠粘度降低,，存儲模量恢復，如圖1b所示,。

圖1 自愈合支撐水凝膠中的生物3D打印球體

如圖2所示,，研究者探討了水凝膠的流變性能對生物打印精度的影響。將聚合物濃度從3 wt%增加到7 wt%會產(chǎn)生具有更高存儲模量的水凝膠,，這需要更高的應(yīng)變來引發(fā)屈服,。研究者進而評估了兩種球體尺寸的生物打印的精度（直徑分別為200和400μm）。對于XY軸精度,，測量了所有聚合物濃度下球體直徑的~8–15％的漂移距離,。對于Z軸精度，測量了所有聚合物濃度下相似的球體直徑~10–15％的漂移距離,。這些漂移可通過在橢球體平移期間(在橢球體左側(cè))的水凝膠位移的熒光映射來可視化,。通常這些距離很小，表明生物打印球體的精度很高,，并支持將球體的高分辨率圖案化,。打印后24小時內(nèi)球體中細胞的活力也得到了評估。在較低的聚合物濃度(3和5 wt%)時,，細胞活力高(~90-95%),，而在最高聚合物濃度(7 wt%)時，細胞活力顯著下降(~87%),。較低的聚合物濃度可能會減少球體平移過程中剪切力的影響,，從而提高細胞的存活率。由于在所有聚合物濃度下生物打印精度都高,，且在低聚合物濃度下細胞存活率最高,，我們在
所有后續(xù)研究中都使用了3 wt%的水凝膠。

圖2 支撐水凝膠流變性和生物3D打印精度

如圖3所示,，研究者接下來探討了定向球體融合是否可用于制造結(jié)構(gòu)受控的多球體微組織,。當球體通過直接接觸進行生物印記時，在培養(yǎng)的四天中觀察到融合,。此外,，當以50μm的分離距離對球體進行生物打印時，觀察到可比較的融合水平,。這些距離在作者方法測得的精度范圍內(nèi),，從而最大程度地減少了球體可以以足夠接近球體融合的方式進行生物打印的擔憂。利用這些特性,，接下來將8個球狀體沉積成環(huán)形,，從而在培養(yǎng)4天后使其連續(xù)融合成微組織環(huán)。可以用多層球體重復此過程,，以形成微組織管,。重要的是，由于支撐水凝膠中交聯(lián)的非共價和可逆性質(zhì)以及柔軟的水凝膠機械性能,，因此可以吸去支撐水凝膠以從融合的微組織中去除,。

圖3 通過定向球體融合生物3D打印微組織

如圖4所示,，研究者使用球體生物打印方法設(shè)計了局灶性心臟纖維化的簡化模型,。為了模擬健康和纖維化的心臟組織，將iPSC衍生的心肌細胞（iPSC-CMs）和人心臟成纖維細胞（CFs）的配成不同比率（“健康”模型 iPSC-CM：CFs=4：1,；“疤痕”模型 iPSC-CM：CFs=1：4）,，這通過對心臟肌鈣蛋白T（cTnT）（CM marker）和波形蛋白（CF marker）的免疫熒光染色進行了驗證。接下來作者進行了收縮記錄并使用開源的肌肉運動軟件來確定收縮幅度（與收縮力相關(guān)）和峰到峰值時間（心跳率或節(jié)奏）,。與3天的疤痕對照組相比,，健康的球體的收縮幅度顯著增加，并且趨向于更快的峰間時間~850ms（~70 bpm）,。光學映射細胞內(nèi)Ca 2+顯示健康球體中的Ca 2+通量穩(wěn)定且同步,，而在疤痕球體中僅觀察到較低水平的Ca 2+通量，且分散而零星分布,。量化了心臟細胞周期的關(guān)鍵參數(shù),，包括鈣瞬變持續(xù)時間（CTD）（ms），峰到峰值時間（ms）和鈣通量幅度（F/Fo）,。健康球體的CTD和鈣通量振幅顯著較高,，健康球體的峰值時間顯著降低（即更快的去極化）�,？傊�,，這些結(jié)果表明，心臟球體中CM：CF
比率的變化證明了構(gòu)建健康和疤痕心臟組織模型的可行性,。

圖4 制造心臟球體用于疾病模型應(yīng)用

通過健康和疤痕球體的定向融合來創(chuàng)建心臟組織的異質(zhì)環(huán),，可模擬局灶性心臟纖維化。環(huán)形結(jié)構(gòu)用于模擬心腔的組織水平電生理特性,，包括再次出現(xiàn)心律不齊的可能性,。為了對健康的心肌建模，對直接接觸的8個健康球體的環(huán)進行了生物打印,，而對有疤痕的心肌模型進行了7個健康球體和1個瘢痕性球體的環(huán)的生物打印,，如圖5所示。培養(yǎng)5天后,，對cTnT和波形蛋白雙重染色證實了相鄰球體之間的融合,，并且在疤痕微組織中觀察到了高成纖維細胞密度的區(qū)域。活死染色顯示融合5天后具有高細胞活力,，并且iPSC-CM與CF的比例在培養(yǎng)期間保持不變,。在微組織的健康區(qū)域也觀察到了健壯的肌節(jié)染色，在疤痕區(qū)域觀察到了較低的水平,。另外,，連接蛋白-43在細胞邊界處的染色表明在微組織的健康區(qū)域中間隙連接的形成，而在疤痕區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的染色水平較低,。微組織環(huán)也以連續(xù)和同步的方式收縮,，從支持水凝膠中取出后可以觀察到。微組織收縮的定量揭示了與健康對照組相比,，疤痕微組織收縮幅度減小的趨勢,，模仿了心肌梗死后整體收縮力的降低。

圖5 生物3D打印心臟微組織用于疾病模型應(yīng)用

如圖6所示,，作者用疤痕心臟球體篩選了一系列miRNA治療持續(xù)時間（0,、0–2、0–4和0–7天）,。為了評估m(xù)iRNA處理的瞬時效果,，在第2、4和7天進行了順序收縮成像,。與未治療的對照組相比,，在相同的時間點，連續(xù)治療4天和7天觀察到的收縮幅度明顯增加,。值得注意的是,，在這些情況下，收縮值增加了大約三倍,，并達到了健康球體中收縮幅度的~20％,。當培養(yǎng)基中仍存在miRNA時，收縮速度也比對照組顯著提高（快2倍）（4天0-4天治療,，7天0-7天治療）,。為了確定miRNA處理是否能促進瘢痕狀球體中CM和CF的增殖，研究者在7天時進行了EdU標記（一種增殖標記）以及cTnT和波形蛋白染色的共染色,。存在cTnT+EdU+島,，表明增殖和克隆擴增，尤其是治療時間較長（0-4天,，0-7天）的情況,。沒有觀察到Edu+細胞的數(shù)量增加，表明miRNA處理主要影響CM增殖,。在健康的球體中也觀察到類似的趨勢,，隨著cTnT數(shù)量的增加與對照組相比,，在所有治療條件下均觀察到Edu+細胞，對CF增殖的影響有限,。

圖6 評估m(xù)iRNA對心臟微組織行為的影響

論文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41467-021-21029-2