清華大學熊卓課題組AM：SPIRIT逐級懸浮打印技術(shù),，讓3D打印復雜器官有形更有“魂”,！

來源：清華大學熊卓課題組

組織/器官的體外功能化重建是生物制造領(lǐng)域長期以來的努力目標,；然而，組織器官的外部復雜結(jié)構(gòu)和內(nèi)部精細特征（如血管等）的耦合構(gòu)建仍極具挑戰(zhàn),。為解決該難題,，清華大學熊卓、張婷課題組（BRE團隊）提出了一種逐級懸浮3D打印技術(shù)（Sequential Printing in a Reversible Ink Template, 簡稱SPIRIT）,，相關(guān)成果近期以“Expanding Embedded 3D Bioprinting Capability for Engineering Complex Organs with Freeform Vascular Networks”為題發(fā)表在材料領(lǐng)域頂刊Advanced Materials（IF = 32.086）上,。利用前期工作中開發(fā)的兼具剪切稀化和自愈合特性的微凝膠雙相（MB）生物墨水，SPIRIT技術(shù)通過將MB生物墨水在多級打印階段分別用作可打印墨水和懸浮介質(zhì),，成功構(gòu)建了含可灌注血管網(wǎng)絡(luò)的心室模型,，這是現(xiàn)有生物3D打印技術(shù)所無法實現(xiàn)的,。SPIRIT技術(shù)有效拓展了常規(guī)擠出3D打印的技術(shù)邊界，能夠?qū)崿F(xiàn)具有復雜宏觀結(jié)構(gòu)和精細血管的組織器官快速構(gòu)建,，有望加速工程化組織器官在醫(yī)學領(lǐng)域的轉(zhuǎn)化應(yīng)用,。

本文第一作者為清華大學機械系生物制造中心方永聰助理研究員，通訊作者為清華大學機械系生物制造中心副主任熊卓副教授,。清華大學機械系生物制造中心主任孫偉教授,、張婷副研究員及碩士生郭依涵、博士生吳炳炎等共同參與了本研究工作,。該研究獲得了國家自然科學基金聯(lián)合基金重點資助項目(U21A20394),，清華大學人才引進啟動經(jīng)費基金(53330200321)，國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFA0703004）和中國博士后科學基金站前資助 (2021TQ0184)等項目支持,。

背景介紹
組織/器官的體外功能化重建是生物制造領(lǐng)域的難題之一,，而生物3D打印技術(shù)憑借精確地逐層堆積生物材料的能力，引起了人們的極大興趣,�,？紤]到水凝膠的力學性能較差，懸浮生物3D打印技術(shù)受到了越來越多的關(guān)注,。簡單來說,，懸浮介質(zhì)具有獨特的剪切稀化和自愈特性，在屈服應(yīng)力下呈流態(tài),，在無應(yīng)力下呈固態(tài),，能夠支撐生物墨水的自由成形，而懸浮介質(zhì)可以通過清洗或升溫的方式被去除,。例如,，卡耐基梅隆大學的研究人員開發(fā)一種FRESH技術(shù)，可以將一個全尺寸的人類心臟模型懸浮打印到明膠微粒介質(zhì)中,。除了外部結(jié)構(gòu)的復雜性外，構(gòu)建功能化組織/器官的另一個障礙是缺乏分級血管網(wǎng)絡(luò),，限制了氧和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞,。犧牲模板技術(shù)和多材料打印技術(shù)被廣泛應(yīng)用于在組織結(jié)構(gòu)中構(gòu)建復雜的血管網(wǎng)絡(luò)，近年來,，懸浮生物3D打印同樣被用來打印具有更高仿生度的血管網(wǎng)絡(luò),。具體來說，將犧牲性墨水懸浮打印至負載細胞的懸浮介質(zhì),，打印后將犧牲墨水溶出得到中空通道,。例如，哈佛大學研究人員提出的SWIFT技術(shù)通過,，通過將明膠犧牲墨水懸浮打印至類器官懸浮介質(zhì)中,，去除明膠后得到可灌注的血管網(wǎng)絡(luò),。總結(jié)而言,，F(xiàn)RESH技術(shù)能夠構(gòu)建復雜外形,，但很難成型血管網(wǎng)絡(luò)等內(nèi)部結(jié)構(gòu)；SWIFT技術(shù)能夠構(gòu)建具有接近生理細胞密度的血管化組織,，然而組織形狀在很大程度上受到容器的限制,，很難復現(xiàn)天然組織和器官的外部結(jié)構(gòu)。

因此,，亟需開發(fā)一種新的3D打印工藝,，以實現(xiàn)復雜組織器官的外部幾何特征和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的耦合成形。為實現(xiàn)該目的,，BRE團隊提出了逐級懸浮生物3D打印技術(shù)（稱為SPIRIT技術(shù)）,，至少包括i）在懸浮介質(zhì)中打印生物墨水，得到組織和器官的復雜外部結(jié)構(gòu),；iii）將犧牲墨水打印到初次打印但未交聯(lián)的結(jié)構(gòu)中,，獲得自由形態(tài)的血管網(wǎng)絡(luò)；iii）原位交聯(lián),，去除懸浮介質(zhì)和犧牲墨水等步驟,。SPIRIT技術(shù)的關(guān)鍵在于使用一種能夠同時作為打印墨水和懸浮介質(zhì)的生物材料，該團隊采用了前期工作開發(fā)的載細胞微凝膠雙相生物墨水,，其在較寬的溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的剪切稀化,、自愈合以及快速原位光交聯(lián)能力，適合于SPIRIT打印技術(shù),。

圖1 逐級懸浮生物3D打印策略

1.MB生物墨水的表征和打印
MB生物墨水由微凝膠和水凝膠前驅(qū)體組成,，通過微流控法來制備（圖2a），變異系數(shù)小于2.5%（圖2b）,。通過流道設(shè)計和流速調(diào)節(jié),，能夠?qū)崿F(xiàn)對微凝膠幾何形狀和大小的控制（圖2c）。MB生物墨水表現(xiàn)出優(yōu)異的打印性能,，能夠打印成各種結(jié)構(gòu)（圖2d-e）,。負載hiPSCs的明膠/海藻酸鹽微凝膠通過鈣離子和微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺（mTG）酶進行雙交聯(lián)，交聯(lián)后的細胞活性處于中等水平（圖2f）,。將微凝膠與相同的水凝膠前驅(qū)體混合,，得到MB生物墨水（圖2g）。打印和交聯(lián)后,，hiPSCs的活力略有下降（圖2h）,，表明打印過程對細胞活力有一定影響。在培養(yǎng)期間,，hiPSCs繼續(xù)增殖,，并傾向于以胚狀體（EB）的形式生長（圖2i）,。胚狀體的直徑隨培養(yǎng)時間而增大（圖2j），表明其具有較快的增殖速度（圖2k）,。第8天免疫熒光染色（圖2l）和流式分析（圖2m）證實hiPSCs能夠保持較好的全能性（>80%）,。在加入心肌細胞分化培養(yǎng)基后，hiPSCs開始向心肌細胞分化（圖2n）,。在分化14天后,，觀察到跳動的心臟類器官（圖2o），證明載hiPSCs MB生物墨水可以通過原位增殖和分化來形成特定組織器官,。

圖2 載細胞MB生物墨水的表征和生物3D打印

2.生物墨水的懸浮打印構(gòu)建復雜結(jié)構(gòu)體
以鋸齒形結(jié)構(gòu)為例（圖3a）進行懸浮打印工藝參數(shù)的優(yōu)化,，為定量比較打印結(jié)構(gòu)和設(shè)計模型之間的差異，使用結(jié)構(gòu)相似性指數(shù)（SSIM）來評估溫度對打印精度的影響,。首先,，將打印結(jié)構(gòu)的圖像轉(zhuǎn)換為二值圖像，進行閾值分割,，以確定平均絲寬和SSIM（圖3b）,。結(jié)果顯示，提高打印溫度會導致細絲加寬,，在24 ℃時SSIM最高（圖3c-d）,。通過在恒定的打印速度下控制擠出速度，可以實時調(diào)節(jié)打印微絲的直徑（圖3e）,。在Carbopol懸浮介質(zhì)中打印了完整的心臟模型（圖3f-g）,、開放腔室（圖3h-i）和支氣管模型（圖3j-k）。通過定量評估管狀結(jié)構(gòu)的形狀保真度,，進一步比較了直接打印和懸浮打印的打印精度（圖3l-m）,。光交聯(lián)后將Carbopol懸浮介質(zhì)去除，懸浮打印結(jié)構(gòu)的外徑和高度略高于模型設(shè)定值,，而直接打印樣本的尺寸略低于模型設(shè)定值（圖3n）,。這可能是因為在懸浮介質(zhì)存在的情況下，細絲層間連接相對不那么緊密,。

懸浮打印結(jié)構(gòu)體可以承受反復的高應(yīng)變拉伸（圖3o-p）,，說明其具有優(yōu)異的力學性能。進一步,，分別對鑄模和懸浮打印的實心圓柱體進行軸向壓縮測試,，獲得應(yīng)力-應(yīng)變曲線,，并計算彈性模量（圖3q）,。懸浮打印結(jié)構(gòu)的彈性模量約為鑄模結(jié)構(gòu)的兩倍（圖3r），表明MB生物墨水的懸浮打印可以應(yīng)用于軟組織結(jié)構(gòu)的制造,。進一步,，以HepG2細胞為例測試懸浮打印工藝對細胞活性的影響,。通過Live/Dead染色來評估細胞活性，并以載HepG2的純GelMA生物墨水作為對照（圖3s-t）,。載細胞微凝膠在3D纖維中分布均勻,，細胞活性略低于對照組的細胞活性（圖3u），可能原因包括MB生物墨水制備過程,、Carbopol懸浮介質(zhì)以及打印過程中的剪切應(yīng)力,；然而，懸浮打印結(jié)構(gòu)中HepG2細胞在前5天表現(xiàn)出比對照組更快的生長速度（圖3v）,。

圖3 懸浮打印MB生物墨水構(gòu)建復雜結(jié)構(gòu)體

3.以MB墨水為懸浮介質(zhì)實現(xiàn)任意形狀血管打印
為驗證MB生物墨水作為懸浮介質(zhì)的能力,，將其轉(zhuǎn)移到一個透明容器中，成功實現(xiàn)了犧牲性明膠墨水的懸浮打�,。▓D4a）,。打印的細絲在不同的擠出速度下呈不同直徑，通過改變擠出速度,，能夠控制細絲寬度為250 μm到1000 μm（圖4b-c）,。MB生物墨水的流變性受溫度影響較小，但打印保真度在一定程度上仍會受到溫度變化的影響（圖4d）,。為實現(xiàn)以MB生物墨水為懸浮基質(zhì)的打印,，將MB生物墨水填充到特定形狀的透明模具中，設(shè)計并打印了一條仿生的分叉通道（圖4e）,。打印后,，進行光交聯(lián)（圖4f-g），將溫度提高到37 ℃去除明膠,，得到中空的通道,。在通道中用藍色墨水灌流，證明它們的可灌注性（圖4h）,。進一步制備載HepG2的MB生物墨水作為懸浮介質(zhì),，在其中打印了可灌流通道，載HepG2的MB生物墨水的初始細胞活性為90%（圖4i）,。灌流培養(yǎng)18小時后觀察,，證明了通道灌流能夠顯著提高整個組織的細胞活性（圖4j）。

進一步,，使用載HUVEC的明膠墨水可以在結(jié)構(gòu)體中形成內(nèi)皮化通道,，在第3天，觀察到HUVECs均勻分布在通道中（圖4k）,。第7天,，細胞增殖使得通道內(nèi)形成一層均勻的內(nèi)皮層（圖4l），同時遷移到周圍基質(zhì)中（圖4m）,。此外,，將紅色MB生物墨水在透明MB生物墨水中懸浮打印網(wǎng)格結(jié)構(gòu),，擠出保真度良好（圖4n-o）。墨水和懸浮介質(zhì)分別使用紅色和綠色GelMA微凝膠,，實現(xiàn)了打印墨水分布可視化（圖4p）,。這些結(jié)果都直接表明MB生物墨水既可以作為打印墨水，也可以用作懸浮介質(zhì),。

圖4 MB生物墨水作為打印的懸浮介質(zhì)

4.SPIRIT打印工藝
如前述,，BRE團隊開發(fā)了新型逐級懸浮打印（SPIRIT）技術(shù),，打印過程如下：（i）一級打�,。簩�MB生物墨水打印到Carbopol或明膠微顆粒懸浮介質(zhì)中，構(gòu)建復雜的外部結(jié)構(gòu),；（ii）二級打印打�,。涸谝患壌蛴⊥瓿珊螅瑢�犧牲墨水打印到尚未交��(lián)的一級打印結(jié)構(gòu)中,，利用MB生物墨水的可逆自愈合性質(zhì)來構(gòu)建任意形狀的血管網(wǎng)絡(luò),；（iii）交聯(lián)：通過原位光交聯(lián)或溫度交聯(lián)，使打印的組織結(jié)構(gòu)固化交聯(lián),，同時保持步驟（i-ii）中打印結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)完整性,；（iv）去除懸浮介質(zhì)和犧牲墨水：通過溫度變化或稀釋等方式去除懸浮介質(zhì)從而得到打印結(jié)構(gòu)，而犧牲墨水可以同時或單獨去除（圖5a）,。與現(xiàn)有3D打印技術(shù)相比,，SPIRIT技術(shù)可以構(gòu)造出具有復雜外部和內(nèi)部精細結(jié)構(gòu)的組織和器官。

為探究墨水濃度對打印性能的影響,，分別制備了含5wt%和7.5wt% GelMA MB生物墨水,，使用Carbopol懸浮介質(zhì)和紅色明膠來測試SPIRIT打印。在一級打印階段,，5%和7.5 % MB生物墨水在Carbopol懸浮介質(zhì)中均順利打印成中空管狀結(jié)構(gòu),；然而在二級打印階段，針頭在7.5 % MB生物墨水中會出現(xiàn)移動和旋轉(zhuǎn)（圖5c）,，而5 % MB生物墨水則不明顯（圖5d）,。可能原因是7.5% MB生物墨水的剪切屈服應(yīng)變遠遠高于懸浮介質(zhì),，而5% MB生物墨水的剪切屈服應(yīng)變則明顯低于懸浮介質(zhì)（圖5e-f）,。因此，采用5 % MB生物墨水打印了含螺旋細絲的管狀結(jié)構(gòu)（圖5g-h）,，在去除懸浮介質(zhì)和犧牲墨水后,，成功用藍色培養(yǎng)液進行灌流（圖5i）。螺旋通道的尺寸接近設(shè)計值，表明SPIRIT打印具有良好的結(jié)構(gòu)保真度（圖5j）,；重復試驗中結(jié)構(gòu)尺寸都非常相似，證明了SPIRIT技術(shù)具有高度可重復性（圖5k）,。

圖5 基于MB生物墨水的SPIRIT工藝研究

5.SPIRIT打印含分級血管網(wǎng)絡(luò)的心室結(jié)構(gòu)
心臟是一個中空的腔室器官,，具有非常密集的血管網(wǎng)絡(luò)，然而現(xiàn)有生物3D打印技術(shù)尚無法構(gòu)建兼具多腔室和血管網(wǎng)絡(luò)的組織結(jié)構(gòu),，因此本研究以血管化心室模型的打印來證明SPIRIT技術(shù)的打印能力,。首先，創(chuàng)建了一個簡化的心室模型,，設(shè)計了一個位于心室模型中間表面的分級血管網(wǎng)絡(luò)（圖6a-b）,。在使用MB生物墨水打印心室結(jié)構(gòu)后（圖6c），繼續(xù)采用紅色明膠墨水進行二級打印以創(chuàng)建血管網(wǎng)絡(luò)（圖6d-f）,。在二級打印階段,，通過控制掃描次數(shù)或在恒定掃描速度下改變擠出速度來調(diào)節(jié)每個分支的直徑，最終成功打印了具有分級血管網(wǎng)絡(luò)的心室結(jié)構(gòu)（圖6g-h）,。在去除懸浮介質(zhì)和犧牲墨水之后,，心室內(nèi)分級血管網(wǎng)絡(luò)可以進行反復的灌流（圖6i-j）。為充分測試SPIRIT的打印能力,，本研究設(shè)計了一種更復雜形狀的血管網(wǎng)絡(luò),。首先在二維平面設(shè)計了一個樹枝狀血管網(wǎng)絡(luò)，進一步彎曲以形成類似于冠狀動脈的血管網(wǎng)絡(luò)（圖6k）,。氧傳遞的數(shù)值模擬結(jié)果顯示致密的血管網(wǎng)絡(luò)可以顯著提高心肌腔室的氧供給效率（圖6l）,。利用SPIRIT工藝成功打印了一個具有變化直徑的致密血管網(wǎng)絡(luò)（圖6m-n）。對打印結(jié)構(gòu)進行微CT掃描,，生成設(shè)計模型和打印結(jié)構(gòu)之間偏差的云圖（圖6o）,，證明SPIRIT打印具有高形狀保真度。需要注意的是,，即使被打印噴嘴剪切了數(shù)百次,，打印心室的幾何形狀仍然完好無損。

進一步評估打印心室的功能,，采用新生大鼠心肌細胞（NRVCs）制備了MB生物墨水,，并打印簡化心室結(jié)構(gòu)（圖6p）。將打印的心室剪切成數(shù)片（圖6q）,，并使用共聚焦成像來獲得結(jié)構(gòu)和細胞信息,。Live/Dead染色表明，在體外培養(yǎng)過程中,，打印的血管網(wǎng)絡(luò)極大地促進了打印組織的活性（圖6r-s）,。第10天，打印的心肌組織發(fā)生同步收縮（圖6f），免疫熒光染色證實了肌原纖維的形成和細胞的相互連接,，表明打印心室的初步成熟（圖6u）,。這些結(jié)果證實了SPIRIT打印心肌組織具有正常功能，顯示了SPIRIT技術(shù)在器官打印等醫(yī)學應(yīng)用中的應(yīng)用前景,。

圖6 SPIRIT打印含可灌注血管網(wǎng)絡(luò)的腔室結(jié)構(gòu)

總結(jié)與展望
本研究開發(fā)了一種新型逐級懸浮生物3D打�,。⊿PIRIT）技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)外部復雜結(jié)構(gòu)和內(nèi)部精細特征的耦合打印構(gòu)建,，并首次打印了一個具有復雜血管網(wǎng)絡(luò)的心室結(jié)構(gòu),，其具有良好的灌注性和收縮性能。此外,，SPIRIT技術(shù)能夠縮短打印時間,，很好地兼容現(xiàn)有的懸浮介質(zhì)和犧牲墨水體系，并可拓展到其他具有剪切稀化和自愈合特性的水凝膠墨水（如超分子水凝膠）,，為復雜組織/器官的體外功能重建提供了新的解決方案,。

參考文獻：Fang Yongcong, Guo Yihan, Wu Bingyan, et al. Expanding Embedded 3D Bioprinting Capability for Engineering Complex Organs with Freeform Vascular Networks. Advanced Materials, 2023, 2205082.

doi: 10.1002/adma.202205082

關(guān)于BRE團隊：
Bioprinting and Regeneration Engineering（BRE）：清華大學生物制造中心生物打印與再生工程團隊，聚焦生物制造,、生物3D打印,、再生醫(yī)學、組織工程等前沿領(lǐng)域,，分享進展,，交流體會。