【文獻(xiàn)分享】基于黃原膠浴懸浮3D打印致密復(fù)雜組織

來(lái)源： 生物打印與再生工程

三維(3D)生物打印越來(lái)越多應(yīng)用于組裝與生物組織的組成、結(jié)構(gòu)和功能類似的結(jié)構(gòu),。在使用高密度細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞可以在無(wú)支架環(huán)境中組裝成復(fù)雜的生理組織結(jié)構(gòu),。但是普通的打印方式無(wú)法平衡細(xì)胞密度與剪應(yīng)力值的關(guān)系,，導(dǎo)致要么因?yàn)楦呒?xì)胞濃度產(chǎn)生的高應(yīng)力值對(duì)于細(xì)胞造成危害；要么因?yàn)榈图?xì)胞濃度無(wú)法進(jìn)行自組裝過(guò)程。并且3D生物打印中一般添加額外的材料,，如水凝膠,，以限制剪切應(yīng)力，并提高形狀保真度和分辨率,。但是水凝膠油墨中可以加入的最大細(xì)胞濃度明顯低于同等組織中的濃度,。此外，水凝膠成分經(jīng)常干擾細(xì)胞的自組裝過(guò)程,。

為了規(guī)避這些限制,，特溫特大學(xué)（UT）應(yīng)用干細(xì)胞系的Robert Passier教授團(tuán)隊(duì)提出了一種簡(jiǎn)單而廉價(jià)的嵌入式打印方法，基于黃原膠浴,，使用由細(xì)胞,、球體、水凝膠珠或其組合組成的稀釋顆粒懸浮液來(lái)3D打印致密的功能性線性組織,。利用這種方法,，Robert Passier團(tuán)隊(duì)證明了功能性心臟組織纖維（心外膜細(xì)胞層圍繞著心肌細(xì)胞體）的自組織過(guò)程。

背景介紹
隨著開創(chuàng)性的研究成果展示了在散裝流體和顆粒介質(zhì)中的嵌入式打印的優(yōu)越性,，引發(fā)了3D生物打印的范式轉(zhuǎn)變,。嵌入式打印允許3D打印低粘度生物墨水，同時(shí)高濃度細(xì)胞懸浮液的打印在碳球顆粒浴中顯示出非常高的保真度和形狀控制,。盡管已報(bào)道的嵌入式打印方法已經(jīng)清楚地展示了該技術(shù)的潛力,，但大多數(shù)刊物中要么使用具有非常高細(xì)胞密度的油墨，導(dǎo)致細(xì)胞暴露于高剪切應(yīng)力值,，要么導(dǎo)致具有低細(xì)胞密度的打印結(jié)構(gòu),，這可能阻礙自組裝成致密的組織結(jié)構(gòu)。在少數(shù)只使用細(xì)胞墨水的嵌入打印案例中,，要么是周圍的嵌入液對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生負(fù)面影響,，要么是細(xì)胞與周圍環(huán)境混合并相互作用。在Brassard等人報(bào)道的唯一案例中,，高細(xì)胞活力和擠壓細(xì)胞懸浮液導(dǎo)致自組裝,，需要復(fù)雜的包埋浴配方和定制的擠壓設(shè)備。此外,，盡管目前的數(shù)據(jù)表明細(xì)胞在打印后被包裝,，但這一過(guò)程并未被描述。

本文提出了一種將稀釋水懸浮液生物打印成致密顯微組織的方法：在屈服應(yīng)力流體浴中打印液滴和線條, 從而最大限度地減少了擠出所需的壓力和油墨內(nèi)產(chǎn)生的剪切應(yīng)力,。油墨在黃原膠包埋液中打印(圖1(B)),，之后液體從打印結(jié)構(gòu)中徑向擴(kuò)散(圖1(C))。這導(dǎo)致懸浮液的液體體積分?jǐn)?shù)急劇下降,，從而將顆粒集中在繪制的軌跡位置,。Robert Passier團(tuán)隊(duì)證明,，這將導(dǎo)致復(fù)雜的微組織纖維的自組裝，并且打印出的微組織纖維僅由生物鏈接的顆粒部分組成(圖1(C)和(D)),。

相對(duì)于Nelson等人的工作,，本文關(guān)鍵的技術(shù)調(diào)整是，本研究中使用的懸浮液由與嵌入液相混溶的液體組成,。此外,，生物墨水描繪了水溶液的粘度，從而最大限度地減少了擠出所需的壓力和墨水內(nèi)產(chǎn)生的剪切應(yīng)力,。此外，這種方法與多種球形實(shí)體兼容,，包括細(xì)胞,、細(xì)胞球狀體和水凝膠微珠，這有可能包括對(duì)發(fā)育組織中的受控化學(xué)或機(jī)械刺激,。

圖1 打印過(guò)程

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

一,、打印參數(shù)優(yōu)化

（1）懸浮油墨密度調(diào)節(jié)

為了實(shí)現(xiàn)一致的油墨性能并允許相關(guān)的打印時(shí)間，在油墨中加入了密度調(diào)節(jié)劑(碘沙醇),，以保持懸浮液的均勻分布,。當(dāng)顆粒與介質(zhì)的密度匹配可以延長(zhǎng)懸浮油墨的操作窗口，因?yàn)樗�可以防止沉降或漂��,，同時(shí)保證顆粒在液相中的均勻分散,。（圖2(A)顆粒懸浮液）同時(shí)當(dāng)顆粒以低體積分?jǐn)?shù)(ϕp < 0.1)均勻分散在密度匹配的液相中時(shí)，顆粒不會(huì)感受到彼此的局部擾動(dòng)流場(chǎng),，顆粒也不會(huì)顯著改變液體的流變特性,。

（2）打印方向探索

通過(guò)不同的打印方向可以得到不同的結(jié)構(gòu)。將噴嘴水平移動(dòng)通過(guò)黃原膠浴導(dǎo)致形成臨時(shí)溝槽,，該溝槽在噴嘴通過(guò)后瞬間充滿黃原膠,。被擠出的材料傾向于沿著噴嘴外側(cè)流過(guò)溝槽，形成片狀結(jié)構(gòu),。(圖2(B (i))) 而當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)噴嘴在浴槽中垂直移動(dòng)時(shí),，導(dǎo)致沿噴嘴路徑打印出一條豎線。(圖2(B (ii))同時(shí)為了防止在水平位移的情況下噴嘴周圍的墨水流動(dòng),，使用了90°彎曲的針打印,。(圖2(B (iii)))

（3）擴(kuò)散堆積現(xiàn)象

通過(guò)用染料標(biāo)記油墨的液相，可以看出液相在擠出后擴(kuò)散到黃原浴中,，形成沿?cái)D出路徑的濃縮顆粒物質(zhì)直線（圖2（C（i-ii）））,。

（4）生物相容性

為了證明該方法的生物相容性，使用直徑約為60 μm的SMC微球在0.1 φp用作懸浮油墨的顆粒部分,，將打印品系培養(yǎng)7 d,，得到完全融合和致密的組織纖維（圖2（D（i-iii）））。

圖2 牛頓流體和稀釋懸浮液的嵌入式 3D 打印

二、擴(kuò)散堆積的機(jī)制

（1）定制成像裝置

Robert Passier團(tuán)隊(duì)準(zhǔn)備了一個(gè)定制的成像裝置,，允許在打印時(shí)對(duì)多個(gè)組分進(jìn)行實(shí)時(shí)多色熒光成像(圖3 (A)和(B)),。

（2）黃原膠浴與牛頓流體浴打印比較

使用這套成像裝置，可以確認(rèn)當(dāng)使用黃原膠浴時(shí),，擠出的材料沿著噴嘴的外部流動(dòng)(圖3(B)),。為了防止這種現(xiàn)象，將黃原膠浴加入2% 海藻酸鹽,，使其表現(xiàn)為牛頓流體,。通過(guò)對(duì)槽的這種調(diào)整，不再發(fā)生回流(圖3(B)),。然而,，雖然在黃原膠海藻酸鹽液中仍然可以打印懸浮液，但擴(kuò)散堆積過(guò)程不再發(fā)生,，而是顆粒與包埋液的近端區(qū)域混合,。這表明黃原膠的剪切變薄和自愈特性對(duì)于顆粒結(jié)構(gòu)的形成至關(guān)重要。

（3）靜態(tài)與移動(dòng)噴嘴以不同注入量打印比較

在1.5%黃原膠液中,，靜態(tài)(i-iii)和移動(dòng)(iv-vi)噴嘴注入量為10 μl時(shí),，溢流(1 ml )、匹配流量(100 μl )和底流(10 μl ),。在溢流的情況下,，液體猛烈地破壞包埋槽，無(wú)論是移動(dòng)的還是靜態(tài)的,。當(dāng)靜態(tài)時(shí),，液體沿著阻力最小的路徑沿著噴嘴表面運(yùn)動(dòng)，當(dāng)噴嘴在擠壓過(guò)程中運(yùn)動(dòng)時(shí),，懸浮液堆積噴嘴體積打開的空腔,。

（4）隨時(shí)間擴(kuò)散堆積成像

為了確定油墨擠出速率對(duì)油墨在黃原膠浴中分布的影響，在保持噴嘴靜止的情況下,，以三種不同的流速注入0.1 φp的香豆素-6 PS顆粒懸浮液,，加入羅丹明B，然后在同時(shí)移動(dòng)噴嘴的情況下重復(fù)不同流速的擠出打印(圖3(D)),。在2ml 的高流速下,，液體噴射并推開黃原膠，形成湍流區(qū)域,。在中間流量為100 μl 時(shí),，觀察到先前觀察到的沿噴嘴回流行為。在10 μl 的低流速下,，觀察到懸浮液緩慢進(jìn)入針尖區(qū)域,。在擴(kuò)散圖中可以觀察到輕微傾斜,，這與圖3(D (v-vi))所示90°彎曲針的輕微角度一致。這進(jìn)一步證明了流入面積由噴嘴結(jié)構(gòu)決定,。

圖3 擴(kuò)散堆積可視化與分析

三,、特征打印

為了演示除直線以外的特征的3D打印，使用含有0.1 φp Fe2O3顆粒的墨水打印了大小網(wǎng)格圖案(圖4(A)),。結(jié)果表明,，特征可以打印重現(xiàn)，并且相交線引起的干擾最小,。此外,，通過(guò)打印一系列具有不同行距的后續(xù)線條來(lái)探索打印紙張的方法(圖4(B))。當(dāng)后續(xù)線的中心間距為400 μm時(shí),，可以形成可復(fù)制的薄片,。較低的300 μm距離會(huì)導(dǎo)致顆粒過(guò)度堆積，形成不規(guī)則的片狀物,。較高的500 μm距離會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)散堆積后的后續(xù)線之間出現(xiàn)間隙。

圖4 復(fù)雜結(jié)構(gòu)打印

四,、平臺(tái)潛力

在本研究中所研究的所有油墨中,，懸浮油墨的顆粒最初都是自由地流入噴嘴圖區(qū)，然后通過(guò)擴(kuò)散堆積進(jìn)行集中接觸,，形成致密的顆粒線,。海藻酸鹽顆粒和膠原顆粒線隨著時(shí)間的推移是穩(wěn)定的。CMs,、IPSCs和SMC球體隨著時(shí)間的推移融合形成微組織(圖5(B) - (D)),。這些組織的形態(tài)根據(jù)所使用的細(xì)胞或細(xì)胞球體的融合電位而變化。主要表現(xiàn)為：SMC球體形成了一種剛性纖維,，可以用鑷子夾起(圖2(C)),，這一特征也可以在其他配方中觀察到，包括iPSCs,，以及SMCs與PLA顆粒的組合,。在沒(méi)有細(xì)胞的情況下，顆粒保持原位,。當(dāng)分別測(cè)試膠原包被顆粒與SMC細(xì)胞和SMC球體的組合時(shí),，隨著時(shí)間的推移，觀察到復(fù)雜組織的自組裝,。由于組織致密,，線條特征轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄠�(gè)組織球，以初始細(xì)胞和球體濃度最高的區(qū)域?yàn)橹行?圖5(E)和(F)),。對(duì)感興趣的區(qū)域進(jìn)行z堆疊成像,，觀察組織結(jié)構(gòu),。這表明，細(xì)胞物質(zhì)包圍了顆粒,，并將它們整合成一個(gè)復(fù)合組織,。

Robert Passier團(tuán)隊(duì)還測(cè)試了不同打印噴嘴的使用，與影響打印分辨率的傳統(tǒng)參數(shù)進(jìn)行比較,，表明使用較小的噴嘴對(duì)線條的平均特征分辨率只有邊際影響（圖5（A））,。并且沿其長(zhǎng)度改善了線寬的一致性。

五,、纖維類器官的自組裝

在第3.4節(jié)中,，觀察到細(xì)胞物質(zhì)融合成纖維，這可以被認(rèn)為是一個(gè)自組裝過(guò)程,，Robert Passier團(tuán)隊(duì)假設(shè)纖維可以隨著時(shí)間的推移進(jìn)一步重塑,。

（1）熒光蛋白標(biāo)定

為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，Robert Passier團(tuán)隊(duì)3D打印了hpsc來(lái)源的CMs和hpsc來(lái)源的心外膜細(xì)胞系,，它們都表達(dá)不同的熒光蛋白,，從而可以跟蹤兩種細(xì)胞類型。hPSC-CMs表達(dá)來(lái)自NKX2.5基因組位點(diǎn)的GFP,，并具有α - actiin - mrubyii融合蛋白,。NKX2.5是一種心臟標(biāo)志物，存在于心臟祖細(xì)胞和收縮的CMs中,，α -肌動(dòng)蛋白是CMs中收縮機(jī)制的一種肌合成蛋白(圖6(A)),。通過(guò)內(nèi)源性表達(dá)COUP-TFII位點(diǎn)的紅色熒光mCherry，可以識(shí)別打印構(gòu)建體中的hpsc -心外膜細(xì)胞,。COUP-TFII在心外膜細(xì)胞中表達(dá),，但在心室CMs中不表達(dá)(圖6(A))。

（2）隨時(shí)間形成纖維

在圖6(B)中,，可以觀察到心臟/心外膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)在3 d內(nèi)形成連接的纖維,。第3天之后，纖維延長(zhǎng)至第8天,，之后纖維縮短,。在細(xì)胞密度過(guò)低的位置，纖維分離成較小的細(xì)胞球體,。

（3）細(xì)胞遷移

如圖6(C)所示,，根據(jù)第0天細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)的熒光分布，打印后細(xì)胞立即隨機(jī)分散,。隨著時(shí)間的推移,，細(xì)胞逐漸在纖維結(jié)構(gòu)內(nèi)遷移，在13 d的時(shí)間過(guò)程中形成雙層組織,，由一層心外膜細(xì)胞覆蓋的CMs體組成,，類似于人類心臟組織中的組織,。

（4）肌節(jié)形成

第13天，共聚焦顯微鏡檢查肌節(jié)的形成,，觀察到纖維組織內(nèi)α -肌動(dòng)蛋白的均勻分布(圖6(D)),。

（5）組織自發(fā)與起搏跳動(dòng)

第8天觀察到自發(fā)性心跳。在心臟纖維電起搏后,，組織開始同步跳動(dòng),，起搏頻率可達(dá)4hz(圖6(E)和(F))。

（6）形成自發(fā)附著的組織纖維

當(dāng)纖維與允許粘附的板表面接觸時(shí),，觀察到組織纖維的自發(fā)附著(圖6(G)),。

圖6 心臟組織的生物打印

總結(jié)

Robert Passier團(tuán)隊(duì)的方法允許簡(jiǎn)單和廉價(jià)的3D打印稀顆粒懸浮液，自組裝形成致密復(fù)雜的組織纖維,。由于不需要水凝膠相,，細(xì)胞和球體很容易融合并組織成功能結(jié)構(gòu)，如跳動(dòng)的心臟纖維打印圖所示,。黃原膠浴可以3D打印具有定義的隔間,，以空間定義的模式刺激隨后打印的組織。由于鍍液的滲透性允許液體擴(kuò)散,，因此可以通過(guò)在鍍液頂部添加簡(jiǎn)單的液體來(lái)引入趨化引導(dǎo),。如心臟纖維起搏所示，機(jī)械和電刺激在培養(yǎng)過(guò)程中也是可能的,。最后，這種方法是廉價(jià)的,，可以很容易地適應(yīng)任何擠出式生物打印機(jī),。