《ACS AMI》：使用低粘度生物墨水打印異質(zhì)3D生物結(jié)構(gòu)

來源： EngineeringForLife

生物打印是一個快速發(fā)展的領(lǐng)域，旨在通過特定細(xì)胞和生物材料的受控空間沉積來重建復(fù)雜的生理微環(huán)境用于體內(nèi)再生和體外建模目的,�,？梢酝ㄟ^合成水凝膠來制造微型結(jié)構(gòu)增強的可調(diào)性和先進(jìn)的生物打印技術(shù),，支持在微擠壓生物打印中創(chuàng)建復(fù)雜的設(shè)計,。然而,，支持全面細(xì)胞生物活性（包括細(xì)胞粘附、遷移,、增殖和分化）的水凝膠是柔軟的且表現(xiàn)出較低的形狀保真度和機械穩(wěn)定性,。

為了應(yīng)對這一問題，研究人員開發(fā)了融合生物打印,。在此方面,，來自韓國高等科學(xué)技術(shù)學(xué)院的Je-Kyun Park團(tuán)隊也進(jìn)行了大量研究，在微結(jié)構(gòu)基底上展示了天然和低粘度水凝膠的高分辨率生物打印,。由于其固體基底,，該平臺僅限于創(chuàng)建單層水凝膠。近日,，該團(tuán)隊又引入了一種新的平臺,，能夠制造具有增強分辨率的多層復(fù)雜3D結(jié)構(gòu)，以充分利用生物打印的多功能性,。用于使用稱為3D微網(wǎng)格-生物墨水覆蓋結(jié)構(gòu)和互鎖培養(yǎng)（3D MOSAIC）平臺的混合生物制造方法來生物打印天然和細(xì)胞相容性哺乳動物水凝膠（圖1）。3D MOSAIC平臺能夠精確沉積低粘度水凝膠,，具有增強的可打印性,、分辨率和穩(wěn)定性，同時保留天然水凝膠的理想特性,。

相關(guān)研究成果以“Hybrid Biofabrication of Heterogeneous 3D Constructs Using Low-Viscosity Bioinks”為題于2023年8月24日發(fā)表在《ACS Appl. Mater. Interfaces》上,。

圖1 使用3D MOSAIC平臺制造低粘度水凝膠3D結(jié)構(gòu)

作者使用商用FDM 3D打印機在微網(wǎng)上打印聚乳酸(PLA)框架,，以方便生打印、堆疊和細(xì)胞培養(yǎng)過程中的處理,。對同一型號的FDM 3D打印機進(jìn)行修改并與注射泵集成,，以創(chuàng)建內(nèi)部開發(fā)的微擠出生物打印機（圖1A）。微網(wǎng)格的平紋編織,，水平和垂直的金屬絲交替地在彼此之上和之下通過,，以毛細(xì)管釘扎效應(yīng)支撐打印的水凝膠，并實現(xiàn)高分辨率生物打�,。▓D1B）,。微網(wǎng)格僅占據(jù)一小部分打印結(jié)構(gòu)（圖1C）。然后,，可以使用設(shè)計用于安裝在6孔板中的對準(zhǔn)器來對準(zhǔn)和堆疊PLA框架的微網(wǎng)格生物墨水層,，以形成3D MOSAIC單元（圖1D、E）,�,；�于該平臺，可以使用天然低粘度水凝膠創(chuàng)建復(fù)雜的微型組織生物結(jié)構(gòu),，包括懸垂結(jié)構(gòu)和中空結(jié)構(gòu)（圖1F）,。

1. 油墨類型、微網(wǎng)格和印刷參數(shù)對印刷結(jié)構(gòu)的影響

在微觀尺度上,，與宏觀系統(tǒng)相比,，表面與體積之比要高得多，導(dǎo)致表面力（例如表面張力）超過體力（例如重力）,。接觸角是3D MOSAIC的重要參數(shù),，因為它影響生物墨水在微網(wǎng)格上的擴(kuò)散和粘附。將磷酸鹽緩沖鹽水(PBS),、聚二甲基硅氧烷 (PDMS),、PDMS與固化劑、纖維蛋白原和明膠以10:1的比例混合的液滴放置在帶有金屬絲的微網(wǎng)上（圖2A,、B）,。聚合物PDMS和低粘度水凝膠纖維蛋白原和明膠以受控尺寸印刷在微網(wǎng)上（圖2C）。

在本研究中,，線對線研究了距離和打印流量作為打印生物墨水尺寸的主要影響因素（圖2D）,。研究了線距在63至508 μm之間的微網(wǎng)格，因為該范圍適合高分辨率打印,，同時為顯微觀察提供足夠大的開放面積百分比,。根據(jù)圖2B中纖維蛋白原的微網(wǎng)格尺寸和接觸角計算在相鄰線之間打印水凝膠線的最大流量(Qmax)。當(dāng)打印在線距為63 μm的微網(wǎng)上時,，纖維蛋白原溢出到相鄰泳道,，因為打印條件不夠敏感,，無法滿足所需的控制（圖2E）。

由于缺乏支撐低粘度水凝膠的微結(jié)構(gòu),，在培養(yǎng)皿上打印的纖維蛋白原寬度比在微網(wǎng)上打印的纖維蛋白原寬度大（圖2E,、F）。纖維蛋白原的寬度由線到線的距離統(tǒng)一,，并且可以通過增加打印流量來加寬（圖2G）,。對于254 μm的線對線距離，纖維蛋白原被打印在微網(wǎng)格的單道上,，流速低于計算的Qmax且對于高于其的流速,，纖維蛋白原逐道溢出（圖2G、H）,。通過側(cè)面觀察,，還可以在低于Qmax 的打印流速下觀察到打印水凝膠的高度（圖2I）。

因此,，基于微網(wǎng)格的生物打印技術(shù)產(chǎn)生了具有高分辨率和可控性的結(jié)構(gòu),。微調(diào)線距和優(yōu)化打印參數(shù)進(jìn)一步促進(jìn)了微網(wǎng)格基底上打印生物墨水的寬度和高度的調(diào)節(jié)，從而能夠制造具有精確尺寸和均勻性的結(jié)構(gòu),。在之后的實驗均使用線距為254 μm的微網(wǎng)格,，因為該尺寸對于具有適當(dāng)穩(wěn)定性和分辨率的生物打印結(jié)構(gòu)來說是實用的。

圖2 油墨類型,、微網(wǎng)格和印刷參數(shù)對印刷結(jié)構(gòu)的影響

2. 利用低打印性的材料制造復(fù)雜的均質(zhì)和異質(zhì)結(jié)構(gòu)

生物打印可以創(chuàng)建復(fù)雜的3D結(jié)構(gòu),，并精確控制空間組織和幾何形狀。使用從圖2獲得的微網(wǎng)格和打印參數(shù),，作者用可打印性較差的天然水凝膠制造了復(fù)雜的均質(zhì)和異質(zhì)結(jié)構(gòu),。使用單一類型的彩色纖維蛋白原將線條和晶格打印在線距為254 μm的微網(wǎng)上，以演示低粘度水凝膠的高分辨率打�,。▓D3A,、B），還根據(jù)圖2G,、H中的表征數(shù)據(jù)調(diào)整打印流量,，以獲得雙通道格式的相同設(shè)計（圖3C、D）,。水凝膠輪廓和交叉點的精確分辨率和清晰定義證明了基于微網(wǎng)格的生物打印的先進(jìn)能力,，可以使用粘度遠(yuǎn)低于適合微擠出打印的常規(guī)范圍的水凝膠創(chuàng)建分隔的微結(jié)構(gòu)。此外,，多種類型的生物墨水可以打印在單層微網(wǎng)格上,。通過在生物打印機頭上安裝兩個打印噴嘴，彩色明膠和纖維蛋白原依次打印為線條、叉狀結(jié)構(gòu),、雙螺旋和分支結(jié)構(gòu)（圖3F-I）。

圖3 使用基于微網(wǎng)格的生物打印使用單一和多種生物墨水打印的單層設(shè)計

3. 3D MOSAIC平臺打印多層和異構(gòu)3D結(jié)構(gòu)

為了創(chuàng)建更全面和多尺度的仿生結(jié)構(gòu),，細(xì)胞相容性水凝膠內(nèi)的自發(fā)和微觀細(xì)胞組織可以與微網(wǎng)格上的直接微擠壓印刷相結(jié)合,。通過應(yīng)用3D MOSAIC平臺建立基于微網(wǎng)格的生物打印來制造異質(zhì)和多層3D結(jié)構(gòu)。三組分結(jié)構(gòu)的腎臟模型被概念化為五層,，并使用三種類型的熒光染料分子標(biāo)記纖維蛋白原進(jìn)行打�,。▓D4A、B）,。打印的纖維蛋白原層在微網(wǎng)上交聯(lián),，具有高形狀保真度和結(jié)構(gòu)完整性（圖4C、D）,。各個層對齊并堆疊以形成2毫米高的完整3D結(jié)構(gòu)（圖4E）,。最終的結(jié)構(gòu)由三種天然低粘度水凝膠組成，具有一般的橢圓形結(jié)構(gòu),，具有部分中空的中部和懸垂的脈管系統(tǒng)和輸尿管突起（圖4F）,。通過提供必要的支撐、穩(wěn)定性和空間控制,，微網(wǎng)格促進(jìn)了在所有三個軸上具有空間自由度的結(jié)構(gòu)的組裝,。該結(jié)構(gòu)展示了多學(xué)科3D MOSAIC平臺在創(chuàng)建復(fù)雜設(shè)計方面的多功能性和潛力，這些設(shè)計不受印刷適性下限的限制,，并且不會變形和塌陷,。

圖4 使用3D MOSAIC平臺打印多層和異構(gòu)3D結(jié)構(gòu)

為了評估制造過程對細(xì)胞活力的影響，對生物墨水混合物后立即在纖維蛋白原中的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)以及在打印40分鐘后直接從注射器和打印噴嘴獲得的生物墨水進(jìn)行了檢查,。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中,，細(xì)胞活力也保持較高水平（圖5B、C）,。HUVEC均勻分布在打印的水凝膠內(nèi),，并且在14天的培養(yǎng)期內(nèi)沒有觀察到打印的纖維蛋白結(jié)構(gòu)明顯變形（圖5B）。因此,，在3D MOSAIC平臺中應(yīng)用低粘度生物墨水不僅可以打印細(xì)胞相容性水凝膠,，還可以為生物打印提供更溫和的條件。

圖5 生物打印過程和細(xì)胞培養(yǎng)期間的細(xì)胞活力

隨后的研究,，作者將細(xì)胞水凝膠生物墨水在微網(wǎng)上的可靠印刷擴(kuò)展到制造更復(fù)雜的結(jié)構(gòu),。使用含有HUVEC和肺成纖維細(xì)胞(LF)的纖維蛋白原打印五層倒金字塔。生物墨水被打印成輪廓清晰的正方形,，尺寸線性增加,，HUVEC分布均勻（圖6A）。這些層分別培養(yǎng)并在培養(yǎng)第7天組裝,，組成一個高度約2毫米,、纖維蛋白壁厚500微米的倒置空心金字塔（圖6B,、C）。在制造方面,，層的堆疊不受限制,，因為微網(wǎng)格有效地固定了印刷的水凝膠結(jié)構(gòu)。重要的一點,，3D MOSAIC在模塊化微網(wǎng)格生物墨水的空間和時間組裝方面非常靈活,。

此外，使用基于微網(wǎng)格的生物打印,，還可以打印這種天然的低粘度水凝膠來制造復(fù)雜的結(jié)構(gòu)（圖6D）,。共培養(yǎng)第7天，HUVEC形成互連的血管網(wǎng)絡(luò),，CD31的免疫熒光染色表明內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的形成,，這對于血管樣結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和維護(hù)至關(guān)重要（圖6E）。分叉網(wǎng)絡(luò)分支的共焦圖像的正交視圖揭示了管狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的管腔（圖6F）,。借助3D MOSAIC平臺,，通過實施具有生物功能的水凝膠，重建了具有高水平的生物和結(jié)構(gòu)仿生學(xué)的生理微環(huán)境,。

圖6 生物打印微型結(jié)構(gòu)內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞的自組織

4. 多層TME的制造和分析

3D MOSAIC平臺能夠利用模塊化層構(gòu)建全面的生理微環(huán)境,。設(shè)計并制作了腫瘤微環(huán)境（TME）模型，其中跨多個組裝層建立了細(xì)胞相互作用,。TME模型由三個環(huán)形層組成,，每個層包含MDA-MB-23乳腺癌細(xì)胞、纖維蛋白以及HUVEC和LF的組合,，代表癌癥,、細(xì)胞外基質(zhì)和脈管系統(tǒng)成分（圖7A、B）,。該設(shè)計旨在模擬TME內(nèi)癌細(xì)胞與微血管系統(tǒng)之間的主動相互作用,。將三層對齊、組裝并培養(yǎng)長達(dá)1周（圖7C）,。培養(yǎng)7天后,，在 MDA-MB-231細(xì)胞的單一培養(yǎng)對照條件下，從其初始層觀察到最小的遷移（圖7D）,。

然而,，當(dāng)HUVEC和LF存在于頂層時，轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出向上遷移,，到達(dá)中層,。此外，觀察到HUVEC向下移動，并且還在中間純纖維蛋白層內(nèi)發(fā)現(xiàn)了HUVEC,。頂層的HUVEC在第7天時形成了內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)（圖7E）,，如之前在圖6中觀察到的。通過正交共焦成像證實了MDA-MB-231細(xì)胞的垂直遷移（圖7F）,。隨著時間的推移,，遷移細(xì)胞的數(shù)量增加（圖7G）�,？偟膩碚f，培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)出活躍的遷移,、基質(zhì)重塑和增殖,，證明了只有使用高細(xì)胞相容性生物墨水時才有可能實現(xiàn)的高水平細(xì)胞生物活性。

圖7 多層TME的制造和分析

綜上,，多學(xué)科3D MOSAIC平臺提供了一種有前途的策略,，可以使用低打印性的天然水凝膠創(chuàng)建復(fù)雜的異質(zhì)3D結(jié)構(gòu)。微網(wǎng)支撐具有毛細(xì)管釘扎效應(yīng)的低粘度水凝膠,，以實現(xiàn)高分辨率結(jié)構(gòu)的生物打印,，隨后將其對齊和堆疊以形成多層結(jié)構(gòu)。在平臺中血管生成條件下培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞在生物功能水凝膠內(nèi)自組織形成血管網(wǎng)絡(luò),。此外,，成功構(gòu)建了結(jié)合癌細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)成分和血管元件的TME模型,，為研究癌細(xì)胞與其周圍微血管之間復(fù)雜的相互作用提供了有價值的工具,。

文章來源：
https://doi.org/10.1021/acsami.3c05750