擠出式生物3D打印構(gòu)建高度組織化結(jié)構(gòu)用于骨骼肌組織工程

來(lái)源： EFL生物3D打印與生物制造

3D生物打印是一項(xiàng)參與構(gòu)建組織工程材料的新興技術(shù),，目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了不同的打印系統(tǒng),。其中，基于擠壓的方法被證明最適合骨骼肌組織工程,，因?yàn)樗�能夠以平行模式生產(chǎn)和沉積印刷纖維，從而很好地模仿天然骨骼肌組織結(jié)構(gòu),。然而,，此功能通常與細(xì)胞需求（例如細(xì)胞粘附和/或吸收性的動(dòng)機(jī)）沒(méi)有很好的相關(guān)性。

為了克服這一障礙,，來(lái)自羅馬大學(xué)生物系的C Gargioli聯(lián)合法國(guó)艾克斯-馬賽大學(xué)的S Testa團(tuán)隊(duì)報(bào)告了一種新型基于擠出3D生物打印系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)和表征及其在小鼠模型中校正體積肌肉損失(VML)損傷的應(yīng)用,。通過(guò)基于PEG-纖維蛋白原的使用獲得了高度組織化的3D結(jié)構(gòu)，其中小鼠肌肉祖細(xì)胞能夠分化成排列成對(duì)齊束的肌纖維,，并且能夠在體外培養(yǎng)時(shí)自發(fā)收縮（圖1）,。

相關(guān)研究成果以“A novel extrusion-based 3D bioprinting system for skeletal muscle tissue engineering”為題于2023年2月3日發(fā)表在《Biofabrication》上。

圖1 3D 生物打印和本體聚合過(guò)程的示意圖

1. 生物打印和散裝結(jié)構(gòu)中肌纖維成熟,、組織和同質(zhì)性的體外分析

印刷系統(tǒng)在維持細(xì)胞粘附,、增殖和分化等生物過(guò)程中的有效性通過(guò)使用鼠類(lèi)中成血管細(xì)胞(Mabs)進(jìn)行評(píng)估。單克隆抗體被添加到由PF組成的生物墨水中,，PF是一種結(jié)合了天然和合成益處的光固化水凝膠,。將獲得的生物打印結(jié)構(gòu)在培養(yǎng)物中保存長(zhǎng)達(dá)30天，以獲得完全分化的肌纖維（圖2A）,。徑向位移表明在單個(gè)抽搐的收縮階段發(fā)生的位移,，在生物打印條件下顯著更高（2.5倍）（圖2B）。此外,，觀(guān)察到不同的抽搐方向性,，平行于生物打印結(jié)構(gòu)中的打印軸，而隨機(jī)定向在大塊結(jié)構(gòu)中（圖2B）,。

圖2 細(xì)胞化結(jié)構(gòu)中肌肉分化時(shí)程的明場(chǎng)成像

在第30天,，在肌肉分化后，針對(duì)肌肉分化標(biāo)記物MyHC和結(jié)蛋白的整體免疫熒光分析對(duì)大塊和生物打印結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析（圖3A）,。圖像分析證實(shí),，PF為Mab的維持提供了有利的微環(huán)境，能夠在兩種條件下增殖和融合以產(chǎn)生大的多核肌纖維（圖3B）,。通過(guò)比較兩種條件下的肌纖維寬度,、長(zhǎng)度和連貫性,，評(píng)估了生物打印結(jié)構(gòu)中肌纖維尺寸更好組織和更大同質(zhì)性的證據(jù)（圖3C）。與體積曲線(xiàn)相比,，生物打印結(jié)構(gòu)中的寬度分布似乎向更大的尺寸移動(dòng)并且更尖銳（圖3C）,。此外，與大塊肌纖維相比,，生物打印結(jié)構(gòu)中的肌纖維平均長(zhǎng)度明顯更高（兩倍）,，這一點(diǎn)也通過(guò)偏移長(zhǎng)度分布得到證實(shí)（圖3D)。

圖3 散裝和 3D 生物打印結(jié)構(gòu)的免疫熒光分析

2. 構(gòu)造部分的分化和纖維排列分析
散裝和生物打印結(jié)構(gòu)都被快速冷凍以用于OCT鑄造以獲得冷凍切片,。免疫熒光分析證實(shí)在兩種情況下都存在結(jié)蛋白陽(yáng)性和MyHC陽(yáng)性肌纖維（圖4A)）,。細(xì)胞能夠產(chǎn)生自己的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，纖維周?chē)鷮诱尺B蛋白的存在證明了這一點(diǎn),，表明細(xì)胞已經(jīng)成熟（圖4A）,。

細(xì)胞密度是一種指示切片內(nèi)細(xì)胞存在和定位的測(cè)量值，在生物打印結(jié)構(gòu)中顯著更高,，反映了肌纖維的更好分布,，而在大塊結(jié)構(gòu)中，細(xì)胞主要位于最外層（圖 4B）,。此外,，在生物打印條件下，在構(gòu)造部分上測(cè)量的圓度和橫截面積分別較高和較低,，表明肌纖維沿構(gòu)造縱軸的排列更好（圖4C）,；另一方面，大塊結(jié)構(gòu)顯示出更大的橫截面積但較低的圓度,，正如預(yù)期的那樣,，肌纖維沒(méi)有定向在一個(gè)單一的方向上（圖4D）。

圖4 結(jié)構(gòu)截面分析

3. 小鼠生物打印結(jié)構(gòu)植入后 TA 體積恢復(fù)
最后,，作者采用VML小鼠模型評(píng)估打印系統(tǒng)在再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的潛力,。生物打印結(jié)構(gòu)被植入物在宿主肌肉內(nèi)整合30天。在對(duì)照小鼠中,，TA 肌肉組織被消融,，但沒(méi)有被人工構(gòu)造取代。與對(duì)照相比,，植入的TA中的組織區(qū)域完全恢復(fù),，而對(duì)照則相反地顯示組織恢復(fù)不良和不足（圖5A）。大量LacZ陽(yáng)性細(xì)胞核被標(biāo)記在重建組織的中央有核肌纖維內(nèi),，證明組織良好（圖5B）,。

圖5 對(duì)消融和植入的小鼠TAs的免疫熒光分析

來(lái)自植入結(jié)構(gòu)的重建組織被證明具有適當(dāng)?shù)难�管化，如富含LacZ陽(yáng)性細(xì)胞核的區(qū)域所突出顯示平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)和血管性血友病因子(vWF)的陽(yáng)性信號(hào),，分別標(biāo)記血管肌肉壁和內(nèi)皮細(xì)胞 (圖6A）,。此外,，呈現(xiàn) LacZ 陽(yáng)性細(xì)胞核的重建肌纖維已被證明是受神經(jīng)支配的，正如通過(guò)磷酸神經(jīng)絲 (pNF) 和α-金環(huán)蛇毒素 (BTX) 免疫染色對(duì)神經(jīng)突觸前和突觸后結(jié)構(gòu)的陽(yáng)性標(biāo)記所證明的那樣,，證明在植入 3D 結(jié)構(gòu)后,，再生的TA肌肉內(nèi)神經(jīng)肌肉接頭的發(fā)展（圖6B）。在nLacZMabs重建的TA區(qū)域觀(guān)察到Pax7陽(yáng)性衛(wèi)星細(xì)胞,，表明重建了肌肉再生所需的干細(xì)胞生態(tài)位（圖6C）,。

圖6 對(duì)3D生物打印結(jié)構(gòu)中nLacZ-Mabs再生區(qū)域的更高放大倍數(shù)分析

4. 人體生物打印結(jié)構(gòu)植入后TA體積恢復(fù)
為了評(píng)估將所提出的方法轉(zhuǎn)化為人類(lèi)研究的可能性，已經(jīng)進(jìn)行了利用肌肉來(lái)源的載有hMSC 的生物打印結(jié)構(gòu)的試點(diǎn)實(shí)驗(yàn),。與上述實(shí)驗(yàn)類(lèi)似,，在50% TA肌肉消融后，將具有人類(lèi)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)植入小鼠后肢,。外植 TA 的橫截面顯示兩個(gè)不同的區(qū)域,，一個(gè)是宿主的天然肌肉，另一個(gè)是源自人類(lèi)生物打印植入物的區(qū)域（圖7A）,。盡管與鼠源性植入物相比，異種移植物形成的組織總體上看起來(lái)組織性較,，但與許多人Lamin A/C (Lam A/C)陽(yáng)性細(xì)胞核共定位的大 MyHC 陽(yáng)性區(qū)域表明重建的肌肉組織來(lái)自人類(lèi),，并且hMSC能夠生成與宿主消融TA整合的肌纖維（圖7B）。

圖7 植入載有hMSC的生物打印結(jié)構(gòu)的小鼠TA橫截面的免疫熒光分析

對(duì)重建的TA組織進(jìn)行更深入的分析顯示,，具有橫向小肌纖維的組織區(qū)域更多,，這些區(qū)域在連續(xù)部分被證明是中央成核和 Lamin A/C陽(yáng)性（圖8A）。從人源性植入物重建的組織也顯示出適當(dāng)?shù)难�管化和神�?jīng)支配,，正如血管（SMA和vWF）和神經(jīng)特異性（pNF和BTX）標(biāo)記物所揭示的陽(yáng)性信號(hào)所強(qiáng)調(diào)的那樣（圖 8B-C）,。此外，在一些纖維的外圍觀(guān)察到Pax7陽(yáng)性衛(wèi)星細(xì)胞的存在,，從而表明重建的TA具有再生潛力（圖8D）,。

圖8 對(duì)源自人類(lèi)細(xì)胞的重建 TA 區(qū)域進(jìn)行更高放大倍數(shù)分析

在這項(xiàng)工作中，所提出的基于PF的無(wú)藻酸鹽擠出3D生物打印系統(tǒng)建立在僅使用PF作為構(gòu)成細(xì)胞支架的水凝膠的基礎(chǔ)上,，被證明是骨骼肌組織工程的一種新穎且具有競(jìng)爭(zhēng)力的工具,。所呈現(xiàn)的結(jié)果突出了這種創(chuàng)新印刷方法在兩個(gè)主要方面的潛力：一方面，獲得體外生物替代品的可能性顯示出能夠自發(fā)收縮的適當(dāng)組織的肌纖維,，這可以代表藥物篩選和肌病研究的生物平臺(tái),；另一方面，印刷結(jié)構(gòu)在小鼠模型中恢復(fù) VML 損傷的功效,，包括小鼠和人源性肌源性祖細(xì)胞,，表明所提出的方法可以代表再生醫(yī)學(xué)的顯著且有效的工具。


文章來(lái)源：
https://doi.org/10.1088/1758-5090/acb573