生物打印里程碑,！上億細(xì)胞密度下突破50um分辨率！

來源： EFL生物3D打印與生物制造

三維 （3D） 工程組織是由生物材料支架和活細(xì)胞組成的人工功能組織,。工程組織已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用,，包括基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究、疾病建模,、藥物測(cè)試,、個(gè)性化醫(yī)療、再生醫(yī)學(xué)和器官移植,。與傳統(tǒng)的2D單層細(xì)胞模型或動(dòng)物模型相比,，3D工程組織有望準(zhǔn)確概括天然組織的3D結(jié)構(gòu)，細(xì)胞類型以及物理和生化環(huán)境,，為體外組織或器官模型提供更好的生物相關(guān)性,，可擴(kuò)展性和可重復(fù)性。此外,，用自體細(xì)胞開發(fā)的3D工程可移植組織和器官可能會(huì)潛在地減輕與器官供體短缺和免疫排斥相關(guān)的問題,。因此，組織工程引起了大量的研究興趣,。然而,，同時(shí)滿足高細(xì)胞密度、高細(xì)胞活力和高分辨率的要求是十分具有挑戰(zhàn)性的,。特別是,，由于光散射，基于數(shù)字光處理的3D生物打印的生物打印分辨率隨著生物墨水細(xì)胞密度的增加而受到影響,。

為解決該問題,，來自美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校的Shaochen Chen團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種新的方法來緩解這種由散射引起的生物打印分辨率的惡化。結(jié)果表明,，在生物墨水中加入碘二醇,，可以將光散射減少10倍，并顯著提高具有HCD的生物墨水的制造分辨率,。本研究成功實(shí)現(xiàn)了利用每毫升細(xì)胞密度為1億的生物墨水進(jìn)行50微米分辨率的制造,。為了展示其在組織/器官三維生物打印中的潛在應(yīng)用，本研究制作了具有細(xì)小血管網(wǎng)絡(luò)的HCD厚組織,。組織在灌流培養(yǎng)系統(tǒng)中存活,，培養(yǎng)14天后可以觀察到內(nèi)皮化和血管生成,。相關(guān)工作以題為“High cell density and high-resolution 3D bioprinting for fabricating vascularized tissues”的文章發(fā)表在2023年2月22日的國(guó)際頂級(jí)期刊《Science Advances》。

1. 創(chuàng)新型研究?jī)?nèi)容
雖然基于擠壓原理的3D打印可以達(dá)到50 μm的標(biāo)稱分辨率,，而基于光的打印可以達(dá)到微米級(jí)的標(biāo)稱分辨率,，但通常只有在特定的優(yōu)化制造條件下才能實(shí)現(xiàn)這樣的精細(xì)特征，而且其中使用的是沒有封裝細(xì)胞的低生物相容性材料,。在實(shí)際的生物打印應(yīng)用中，使用細(xì)胞封裝的生物油墨與標(biāo)稱情況相比,，制造分辨率往往大大惡化,。對(duì)于基于擠壓的3D生物打印，增加細(xì)胞密度或在生物墨水中使用球體需要使用更大的噴嘴,。否則,，由于擠壓過程中所經(jīng)歷的剪切應(yīng)力，細(xì)胞活力明顯受到影響,。通常,，對(duì)于1000萬個(gè)細(xì)胞/ml或更高的密度，應(yīng)該使用200 μm或更大的噴嘴,，其打印分辨率在200- 500 μm之間,。對(duì)于基于光的方法，由于細(xì)胞引起的光散射效應(yīng),，典型的細(xì)胞封裝生物打印分辨率為幾十到幾百微米,。雖然一些化學(xué)添加劑可以減輕光散射引起的不必要的聚合，但這些化學(xué)物質(zhì)通常具有細(xì)胞毒性,。在DLP和大體積3D生物打印中,，部分研究人員也提出了計(jì)算方法來減輕散射的影響并提高細(xì)胞負(fù)載生物墨水的制造分辨率。然而,，這些研究?jī)H限于低細(xì)胞密度(≤1000萬個(gè)細(xì)胞/ml),。因此，很難制造同時(shí)具有HCD(≥2000萬個(gè)細(xì)胞/ml),、高細(xì)胞活力(≥80%)和高制造分辨率(≤50 μm)的3D生物打印結(jié)構(gòu),。本研究稱之為3D生物打印中的密度-生存力-分辨率三難困境(圖1)。

圖1 在HCD生物墨水中實(shí)現(xiàn)高制造分辨率

研究表明,，通過折射率調(diào)節(jié),，細(xì)胞和周圍生物材料之間折射率不匹配引起的散射可以最小化(圖1)。生物墨水光學(xué)特性的測(cè)量和光傳播的模擬證實(shí),，IDX可以有效地調(diào)節(jié)生物墨水的折射率,，從而大幅減少由被包裹的細(xì)胞引起的光散射(約10倍)。在這里,，展示了用HCD(1億細(xì)胞/ml)進(jìn)行3D生物打印,，制作分辨率為50 μm,。免疫熒光圖像和RNA測(cè)序(RNA-seq)也驗(yàn)證了健康和功能的3D工程組織可以使用這種方法制造。在生物墨水中加入IDX時(shí),，細(xì)胞的活力,、增殖或表型沒有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著變化。本研究還證明,，可以制備厚的預(yù)帶血管組織,，其總尺寸為17 mm × 11 mm × 3.6 mm，血管通道直徑為250 ~ 600 μm,，細(xì)胞密度為4000萬個(gè)細(xì)胞/ml,。灌注培養(yǎng)14天后，觀察到這些組織的內(nèi)皮化和血管生成,。

圖2 光學(xué)性質(zhì)和光能分布

本研究通過在生物打印機(jī)的工作波長(zhǎng)（405 nm）下測(cè)量了包含 5% GelMA 和各種濃度的 IDX 的生物墨水的折射率,，驗(yàn)證了 IDX 可以有效地調(diào)整折射率。如圖 2所示,，當(dāng) IDX 濃度從 20% 增加到 35% 時(shí),，生物墨水的折射率線性增加。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了適當(dāng)濃度的 IDX 可以有效降低生物墨水的散射效應(yīng),。材料的散射效應(yīng)通常用散射系數(shù),、各向異性和折減散射系數(shù)來表征。本研究制備了包含 5% GelMA,、4000 萬個(gè)細(xì)胞/ml 和各種 IDX 濃度的生物墨水,，并使用結(jié)合蒙特卡羅模擬和粒子群優(yōu)化算法的方法來確定生物墨水在生物打印機(jī)工作波長(zhǎng)（405 nm）下的散射特性。這些生物墨水的測(cè)量散射系數(shù),、各向異性和減少的散射系數(shù)如圖 2（B 至 D）所示,。高散射系數(shù)和接近 1 的各向異性值表明載有細(xì)胞的生物墨水是高度光散射的，主要是前向散射,。沒有調(diào)整折射率的生物墨水的散射系數(shù)為 11.76 mm-1,，散射系數(shù)降低為 0.164 mm-1。通過使用 30% IDX 調(diào)整折射率,，生物墨水的散射系數(shù)大幅降低至 1.377 mm-1,，降低后的散射系數(shù)降低至 0.014 mm-1，這意味著這種方法可以將散射降低約 10 倍,。通過仔細(xì)調(diào)整 IDX 的濃度,，可以進(jìn)一步減少散射。

圖3 生物相容性分析

為了驗(yàn)證 IDX 與各種生物材料和細(xì)胞類型的生物相容性,，本研究使用三種常用配方對(duì)薄板進(jìn)行了生物打�,。篏elMA 中的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC)、甲基丙烯酸縮水甘油酯透明質(zhì)酸 (GMHA) 中的人雪旺細(xì)胞 (HSC) 和藻酸鹽甲基丙烯酸酯 (AlgMA) 中的 C2C12,。由于理想的 IDX 濃度范圍在 20% 到 35% 之間變化,，本研究比較了使用 0% 或 35% IDX 的 3D 打印組織,。使用 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 測(cè)定法測(cè)量的代謝活性強(qiáng)度表明，在 7 天的培養(yǎng)過程中,，所有三種類型的生物墨水中封裝的細(xì)胞呈指數(shù)增長(zhǎng),。此外，與對(duì)照相比,，使用 IDX 對(duì)細(xì)胞的代謝活性沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著影響,，這意味著 IDX 不會(huì)阻礙細(xì)胞增殖（圖 3）。此外,，本研究還使用活/死染色來表征細(xì)胞活力,。GelMA 生物墨水中的 HUVEC 打印為 IDX 為 0 或 35% 的薄板�,？傮w而言，在培養(yǎng)的第 1 天和第 7 天,，大多數(shù)細(xì)胞對(duì)于 0% 和 35% IDX 樣本都是存活的,。在 0% 和 35% IDX 之間沒有觀察到顯著的質(zhì)量差異，這意味著IDX 的摻入不會(huì)顯著影響細(xì)胞活力,。

圖4 3D打印血管化可灌注厚組織

由于細(xì)胞誘導(dǎo)的光散射引起的密度-生存力-分辨率三難困境,，以前使用基于光的方法對(duì)預(yù)血管化組織進(jìn)行直接 3D 打印的研究通常局限于無/低細(xì)胞密度或制造分辨率差。本研究設(shè)計(jì)并3D打印了一個(gè)厚的（17 mm x 11 mm x 3.6 mm）預(yù)血管化組織結(jié)構(gòu)（圖 4）,，而且使用的是折射率匹配的生物墨水（包含 4000 萬個(gè)細(xì)胞/ ml）,。中空血管通道的直徑范圍為 250 至 600 μm。HUVEC 和人真皮成纖維細(xì)胞 (HDF) 分別以 23 和 1700 萬個(gè)/ml 的密度封裝在 GelMA 生物墨水中,。圖 4顯示了 3D 打印結(jié)構(gòu)的顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描 (μCT) 圖像（透視圖和橫截面）和打印結(jié)構(gòu)的明場(chǎng)顯微圖像（頂視圖和橫截面）,。在支架中觀察到空心通道，這意味著所需的復(fù)雜微觀結(jié)構(gòu)特征可以以高分辨率和高保真度打印在細(xì)胞化支架中,。這證實(shí)了高密度,、均勻混合的細(xì)胞被封裝在印刷結(jié)構(gòu)中。

2. 總結(jié)與展望
本研究在添加了 IDX 的 GelMA 生物墨水中實(shí)現(xiàn)了 50 μm 的分辨率,，細(xì)胞密度為 1 億個(gè)細(xì)胞/ml,。此外，能夠用細(xì)胞密度高達(dá) 2.25 億個(gè)細(xì)胞/ml的墨水3D打印 GelMA 圓柱體結(jié)構(gòu)（直徑 1.5 毫米,，高度 1 毫米）而不會(huì)影響結(jié)構(gòu)完整性,。這些 HCD 工程組織柔軟（楊氏模量約為 1 kPa）但穩(wěn)定，并且它們?cè)诓僮鬟^程中不會(huì)分解,。雖然這種柔軟的結(jié)構(gòu)在獨(dú)立時(shí)難以操作,，但如果印在蓋玻片上則很容易操作。雖然它們的細(xì)胞密度仍低于生理上觀察到的水平（1 至 30 億個(gè)細(xì)胞/ml）,，但該技術(shù)可同時(shí)實(shí)現(xiàn)具有 HCD,、高活力和高分辨率的 3D 生物打印,。該技術(shù)簡(jiǎn)單明了且可推廣，可輕松應(yīng)用于大多數(shù)生物材料和細(xì)胞類型,。這是朝著能夠制造功能性大規(guī)模,、臨床可移植組織或器官邁出的重要一步，其中 HCD 和精細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)是必不可少的,。

文章來源：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ade7923