高性能水凝膠的3D生物打印及干細胞球體的原位生成

來源： EngineeringForLife

基于數(shù)字光處理（DLP）的生物打印技術(shù)為水凝膠結(jié)構(gòu)在生物醫(yī)學應用中的發(fā)展提供巨大的前景,。然而,，用這種方法創(chuàng)建高性能的水凝膠結(jié)構(gòu)仍然是一個挑戰(zhàn)，因為需要平衡基質(zhì)的物理化學性質(zhì),，同時也需要保留被封裝細胞的細胞活性,。在此，第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院劉銳等提出了一個簡單而實用的策略,，通過原位生成干細胞球狀體來進行高性能水凝膠結(jié)構(gòu)的3D生物打印,。該策略通過將細胞/右旋糖酐微滴裝載在甲基丙烯酰化明膠（GelMA）乳液中實現(xiàn),，其中右旋糖酐作為誘餌捕獲并聚集細胞用于生物打印,，而GelMA可以在不失去結(jié)構(gòu)復雜性和保真度的情況下實現(xiàn)機械支持。生物打印后,，右旋糖酐的浸出導致一個光滑曲面,，促進水凝膠結(jié)構(gòu)中球狀體的原位生成。這一過程顯著提高封裝干細胞的分化潛能,。作為概念驗證,，本研究將牙髓干細胞（DPSCs）封裝在水凝膠結(jié)構(gòu)中，展示了它們在體內(nèi)牙本質(zhì)和新生血管樣結(jié)構(gòu)中的再生能力,。本研究策略使基于DLP的生物打印的高性能水凝膠組織構(gòu)建制造成為可能,，有望為多種生物醫(yī)學應用鋪平一條有前途的道路。

相關(guān)研究內(nèi)容以“3D bioprinting of high-performance hydrogel with in-situ birth of stem cell spheroids”為題于2024年9月29日發(fā)表在《Bioactive Materials》上,。

圖1 生物墨水的特征

為了在生物打印過程中能夠原位形成干細胞球狀體,，本研究開發(fā)了一種各向異性的生物墨水，稱為細胞濃縮生物墨水（CCB）,，以右旋糖酐作為細胞誘餌捕獲封裝的干細胞,，以GelMA作為基質(zhì)提供結(jié)構(gòu)支持，從而促進高性能水凝膠組織結(jié)構(gòu)的生物打�,。▓D1a）,。在水凝膠結(jié)構(gòu)形成的基礎(chǔ)上,，所有混合細胞均在右旋右聚糖酐溶液中濃縮，在GelMA溶液中未檢測到信號（圖1b）,。通過兩相簡單組合,，可以得到不同大小分布的葡聚糖微滴（圖1c）。在CCB水凝膠固化后,，超過80 %的右旋糖酐在24小時內(nèi)被有效消除（圖1d）,。此外，本研究評估了所得到水凝膠結(jié)構(gòu)的力學性能（圖1e）,。CCK-8檢測結(jié)果表明,，多孔結(jié)構(gòu)促進封裝的NIH/3T3細胞的增殖（圖1f）�,；�/死熒光染色顯示,，生物墨水孵育5天后對被封裝的細胞沒有毒性（圖1g）。掃描電鏡（SEM）證實,，15 %組細胞呈聚集和擴散形態(tài),，而標準組、10 %和7.5 %組細胞呈圓形（圖1h）,。活/死檢測和SEM圖像也顯示15 %的細胞組所需的細胞活力(圖1i）,。根據(jù)上述結(jié)果,，將10 %（w/v）的右旋糖酐溶液與15 %（w/v）的GelMA溶液以1：2的體積混合，用于打印組織結(jié)構(gòu),。

圖2 生物墨水的可打印性

通過利用優(yōu)化的生物墨水配方,，本研究打印了幾個具有代表性的結(jié)構(gòu)，從簡單的2D模式到具有復雜內(nèi)外結(jié)構(gòu)的3D結(jié)構(gòu),，用于評估可打印性,。利用生物墨水的優(yōu)勢，成功創(chuàng)建不同形狀的無細胞支架（如車輪,、心臟和半月板）（圖2a-c）,。同時，本研究探索了充滿細胞的生物墨水打印仿生結(jié)構(gòu)的潛力,，將細胞準確地沉積到指定區(qū)域,，以引入更準確的生理特征。圖2d-f顯示,，使用生物墨水的DLP生物打印能夠制造復雜的組織結(jié)構(gòu),，包括膠質(zhì)母細胞瘤模型、分層皮膚模型和血管前肝水凝膠模型,。以上結(jié)果證明了生物墨水制造高精度結(jié)構(gòu)制造的能力,。

圖3 水凝膠結(jié)構(gòu)的3D生物打印可調(diào)節(jié)封裝干細胞活性,，并促進MSCs球狀體的原位形成

圖4 水凝膠中rDPSCs的多譜系分化

本研究開發(fā)了一種細胞濃縮的生物墨水，并假設(shè)所提出的生物墨水可以促進干細胞球狀體的原位誕生,。采用大鼠牙髓干細胞（rDPSCs）來證明該假設(shè),。如圖3a所示，水凝膠中封裝的rDPSCs在孵育5天內(nèi)表現(xiàn)出較高的細胞相容性,。H&E和鬼筆環(huán)肽染色進一步證實生物墨水促進MSCs的3D克隆擴增（圖3b,、c）。除干細胞聚集外,，CCB組包裹的rDPSCs增殖顯著增強（圖3d）,。接下來，在基因表達水平上研究封裝rDPSCs在水凝膠中的多能性,，結(jié)果顯示,，CCB組的干性標志物（OCT4、SOX2和NANOG）的表達顯著上調(diào)（圖4e）,。這一結(jié)果表明了生物墨水在封裝干細胞和促進球狀體形成方面的獨特優(yōu)勢,，反過來又增強其干細胞特性的維持。為進一步研究其轉(zhuǎn)錄反應,，本研究檢測在不同水凝膠結(jié)構(gòu)下培養(yǎng)的rDPSCs的轉(zhuǎn)錄組測序分析（RNA-seq）,，以分析其差異�,；鹕綀D顯示,，兩組間有1018個基因存在差異表達，其中444個基因下調(diào),，574個基因上調(diào)（圖3f）,。其干性相關(guān)基因（Egr2、CD44,、Lif,、Klf4、Klf6）在CCB組中的表達顯著上調(diào)（圖3g）,。GO富集表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)的富集,、對外界刺激的響應、細胞-細胞粘附的調(diào)節(jié),、細胞因子介導的信號通路,、對營養(yǎng)物質(zhì)的響應和組織重塑（圖3h）。為進一步研究CCB水凝膠結(jié)構(gòu)中原位rDPSC球狀體形成的轉(zhuǎn)錄反應,，生成一個熱圖來顯示與粘附,、細胞外基質(zhì)組織和血管生成相關(guān)的代表性基因的表達變化（圖3i）。分析發(fā)現(xiàn)Cdh13,、Lgals1,、Megf10和Abi3bp與細胞粘附密切相關(guān),，Col27a1、Mmp13,、Mmp14,、Adamts7和Gas6是參與細胞外基質(zhì)組織調(diào)控的關(guān)鍵基因，F(xiàn)gf22,、Vegfa,、Vegfb和Bmp4參與血管生成�,；�因集合富集分析（GSEA）表明,，細胞粘附分子、細胞連接和細胞外形成的正調(diào)控作用的富集（圖3j）,。綜上所述,，CCB水凝膠包裹rDPSC促進這些生物過程和分子功能的富集，有利于組織再生,。

為了研究封裝的rDPSCs的分化能力,，將制備的水凝膠結(jié)構(gòu)與相應的分化培養(yǎng)基共同孵育。如圖4a-d所示,，CCB組的rDPSCs在培養(yǎng)期間比標準組的細胞表達更高的成骨標記基因,。如圖4m所示，CCB組中的rDPSCs有更多的礦物質(zhì)沉積,。與標準組相比,，實驗組封裝的rDPSCs顯示II型膠原和SOX9的成軟骨基因表達水平更高（圖4e、f）,。相反，雖然標準組中Col-1和Col-x的基因表達隨著培養(yǎng)時間的延長而下降,，但它們在封裝的rDPSCs中的表達仍遠高于CCB組（圖4g,、h）。誘導21天后,，用沙黃O染色法鑒定富含蛋白多糖基質(zhì)的存在,。CCB組的沙黃O染色強度強烈，表明GAG的產(chǎn)生程度最大（圖4n）,。在水凝膠結(jié)構(gòu)中,，封裝rDPSCs的成脂分化顯示出與成骨和軟骨分化相似的結(jié)果（圖4i-l、圖4o）,。綜上所述,，CCB水凝膠可以促進干細胞球狀體的原位生成，從而增強其增殖,、多能性和分化,。

圖5 生物打印水凝膠在新生血管形成中的應用

本研究利用人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）通過試管形成和遷移實驗評估CCB水凝膠結(jié)構(gòu)的血管生成潛力,。如圖5a所示，在由負載DPSC的CCB水凝膠結(jié)構(gòu)的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HUVECs顯示出顯著的形成毛細血管樣網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的能力,，超過對照組,。血管生成參數(shù)的顯著改善強調(diào)了CCB水凝膠結(jié)構(gòu)在促進血管網(wǎng)絡形成方面的性能增強（圖5b）。與標準組相比,，CCB組的遷移HUVECs計數(shù)明顯更高（圖5c）,。接下來將hDPSCs和HUVECs結(jié)合制備了混合細胞球狀體，并在體內(nèi)評估新生血管的形成情況,。將生物打印水凝膠植入裸鼠背部（圖5d）,。CCB組在整個水凝膠中觀察到一個充滿紅細胞的豐富血管網(wǎng)絡（圖5e），表明有強大的血管化,。H&E量化結(jié)果顯示,，CCB組的血管密度、平均血管直徑和管腔密度均高于標準組（圖5h）,。CCB組中CD31陽性區(qū)域顯著升高（圖5f,、i），表明水凝膠結(jié)構(gòu)有效促進體內(nèi)新血管形成,。微血管顯示 人CD31染色陽性,，證實血管腔內(nèi)有植入的HUVECs（圖5g）。   

圖6 皮下模型中牙髓樣組織的重建

將大鼠來源的牙本質(zhì)基質(zhì)（TDM）根切片填充3D生物打印水凝膠并植入SD大鼠皮下（圖6a i）,，以實現(xiàn)血管生成和牙源性分化（圖6a ii）,。植入8周后，對植入部位的中央,、外周區(qū)域進行組織學評估（圖6b）,。H&E染色結(jié)果顯示，標準組支架無細胞內(nèi)容物,，近端有少量組織浸潤,；CCB組表現(xiàn)出顯著的組織再生（圖6c、d）,。Masson三色染色顯示,，CCB組清晰可見膠原纖維（圖6e）。免疫組化顯示CCB組中的相關(guān)標志物表達增加,，包括牙生成-DSPP（圖6f）,、血管-CD31，圖6g）,、神經(jīng)-NF200（圖6h）,，證實了CCB水凝膠有效促進髓-牙本質(zhì)復合樣組織重建。   

全文小結(jié)
綜上所述，本研究證明了細胞濃縮生物墨水CCB的適用性,，以支持基于DLP的具有干細胞球狀體原位形成的組織結(jié)構(gòu)的生物打印,。本研究開發(fā)的生物墨水有助于高性能水凝膠結(jié)構(gòu)的制造，并顯著提高細胞活力,，同時保持其結(jié)構(gòu)的復雜性和保真度,。這些結(jié)構(gòu)有效地將嵌入的細胞集中在右旋糖酐階段。受彎曲形態(tài)和高細胞密度影響的干細胞傾向于聚集成球狀體,，導致干細胞干性和分化潛能增強,。此外，本研究中的水凝膠證明了在體內(nèi)支持血管化和再生牙本質(zhì)的能力,�,；�于以上��(shù)據(jù)，本研究提出一個簡單而實用的策略,，即通過使用細胞濃縮生物墨水原位生成干細胞球狀體生物打印水凝膠組織結(jié)構(gòu),，在組織工程和再生醫(yī)學中顯示出巨大的潛力。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.09.033