高分辨率3D打印活性酶催化載體，通過精細(xì)結(jié)構(gòu)提高連續(xù)催化反應(yīng)器合成效率

來源：摩方高精密

在生物化工領(lǐng)域中,，酶催化反應(yīng)因其高效性和對合成環(huán)境的相對寬容性而聞名,，常用于合成和加工經(jīng)濟價值高且難以通過傳統(tǒng)化學(xué)合成途徑獲取的化合物,。然而,，酶催化反應(yīng)所需的活性酶往往價格不菲，且在傳統(tǒng)合成流程中不易分離,，這不僅造成了資源的嚴(yán)重浪費,，還使得酶催化流程的成本控制成為一大挑戰(zhàn)。因此,，學(xué)術(shù)界致力于探索將活性酶負(fù)載于催化載體的方法,，通過構(gòu)建連續(xù)催化反應(yīng)器，使反應(yīng)物連續(xù)流經(jīng)并接觸載體上的活性酶,，從而實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)。這一方法避免了酶直接進入反應(yīng)液,，省去了后續(xù)的分離步驟,，提高了酶的利用效率和經(jīng)濟性。但此模式亦存在加工效率不高的問題,，原因是酶未直接置于體系中,，與反應(yīng)物的接觸面積受限，使得合成效率不及直接在體系中分散酶的方法,。

3D打印技術(shù)的興起為生物基連續(xù)催化反應(yīng)器的制造帶來了新契機,。該技術(shù)允許用戶精確制備催化載體的三維空間結(jié)構(gòu)，從而最大化載體中的活性酶與反應(yīng)物的接觸面積,，進而提升反應(yīng)器的生產(chǎn)效率,。近年來，已有研究通過將活性酶催化劑固定于高分子水凝膠網(wǎng)絡(luò)中的方法,，成功制造了有催化活性的載體結(jié)構(gòu),。然而，這類結(jié)構(gòu)所面臨的一個主要挑戰(zhàn)是反應(yīng)物難以充分接觸載體內(nèi)部的活性酶：由于受限于基材的擴散性能,，往往僅有表面的酶能有效地發(fā)揮催化作用,，導(dǎo)致內(nèi)部酶的利用不充分。

針對這一問題,，來自諾丁漢大學(xué)的研究團隊采用摩方精密面投影微立體光刻（PμSL）3D打印技術(shù)及創(chuàng)新的水凝膠配方,，在保持催化酶活性的前提下，成功制造出精度高達10 μm的精細(xì)催化載體結(jié)構(gòu),。這一突破顯著增強了催化載體與反應(yīng)物的接觸,，進而提升了整個系統(tǒng)的催化效率。相關(guān)成果以“High resolution 3D printed biocatalytic reactor core with optimized efficiency for continuous flow synthesis”為題發(fā)表在期刊《Chemical Engineering Science》上。

該文章中的生物催化反應(yīng)器芯是利用摩方精密nanoArch® S130（精度：2 μm）3D打印設(shè)備直接打印加工而成,。文中使用的光固化配方由聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）,，苯基磷酸鋰（LAP），檸檬黃和β-半乳糖苷酶配置而成,，能夠?qū)崿F(xiàn)最小10 μm的孔道結(jié)構(gòu),，并具有高保真度的最小50 μm的方形流道。相較于無流道結(jié)構(gòu),，通過PμSL技術(shù)加工的三維酶基催化劑實現(xiàn)了提升催化效率,，最高可達60%，并且通過將靜態(tài)反應(yīng)器修改成動態(tài)連續(xù)反應(yīng)器的方式,，整個動態(tài)催化系統(tǒng)的催化效率相較于靜態(tài)催化系統(tǒng)提高了240%,。

圖1. 生物催化活性3D打印反應(yīng)器核心，具有精確控制的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),。a）用于樹脂的試劑的化學(xué)結(jié)構(gòu),。b）面投影微立體光刻（PµSL）。c） 甲基丙烯酸硅烷化硅基板在打印過程中與3D打印的反應(yīng)器核心共價結(jié)合,，防止打印中途脫落,。打印后，硅基板可輕松從平臺上分離,。d）3D打印的微米級通道壁厚w和邊長p的水凝膠示意圖,。酶在打印過程中被原位捕獲在納米級聚合物網(wǎng)絡(luò)中（PEGDA 700的長度為4.7 nm）。e）不使用硅烷化基板進行3D打印的示例,。打印過程中從構(gòu)建平臺上脫落并粘附到膜上,，導(dǎo)致保真度差。f）剛打印出的空氣中的嵌入式酶（β-半乳糖苷酶）3D打印水凝膠（2 mm立方體,，p=150 µm, w=100 µm,，帶有7×7個水平對齊的通道）。在硅烷化基板上打印,。g）打印件從平臺分離并浸入水中,。h）具有卓越分辨率的高保真通道（可實現(xiàn)的最小通道尺寸為10 µm）。

實驗表明,，β-半乳糖苷酶在未固化的聚乙二醇二丙烯酸酯中暴露160分鐘后,，仍能保留80±10%的活性。同時,，通過測量打印件浸泡在緩沖液中上清液的活性發(fā)現(xiàn),，β-Gal被水凝膠包裹后幾乎沒有滲出，這進一步證明了該方法的有效性,。

團隊人員在非流動條件下對含β-半乳糖苷酶的催化結(jié)構(gòu)活性進行了初步評估,。以邊長為2 mm的立方體,、水平排列7×7 通道（通道寬度150μm、壁厚100 μm）的反應(yīng)器核心為例,。分光光度法結(jié)果顯示,，420 nm處含酶的反應(yīng)器核心產(chǎn)生的產(chǎn)物信號明顯強于不含酶的樣本，證明了該反應(yīng)器核心用于酶催化的可行性,。

圖2. 通過靜態(tài)分析確定 3D 打印反應(yīng)核心的酶活性,。a）首先在無流動的小瓶中對 3D 打印反應(yīng)核心進行分析。b ）反應(yīng)的展開示意圖,。底物ONPG在3D打印反應(yīng)堆芯內(nèi)嵌入的 β-半乳糖苷酶的催化下發(fā)生水解,，產(chǎn)生半乳糖和ONP。其中,，ONP的吸光度用于量化酶活性,。c ）分光光度計測試結(jié)果表明，嵌入酶的3D打印反應(yīng)核心與不嵌入酶的3D打印反應(yīng)核心相比,，產(chǎn)品信號顯著,。具有代表性反應(yīng)核心部件參數(shù)為邊長為2 mm立方體，p=150 µm,，w=100 µm,，水平排列7 × 7 通道。各測試三個樣本,，p < 0.001。誤差線表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差 (sem),。

隨后,，文章探討了不同打印結(jié)構(gòu)對反應(yīng)器性能的影響。以無通道的立方體為參考樣本,，結(jié)果表明隨著催化結(jié)構(gòu)的邊長增加,，比活性和合成速率均降低。這是因為催化核心尺寸增大時,，位于中心區(qū)域的酶與反應(yīng)物之間的擴散路徑變長,，導(dǎo)致酶的利用效率降低，同時產(chǎn)物擴散也受到阻礙,。這表明傳統(tǒng)無通道反應(yīng)器在擴大規(guī)模生產(chǎn)的過程中,，若不解決酶活性中心的可及性問題，增加體積會導(dǎo)致產(chǎn)量迅速達到瓶頸,。

基于上述現(xiàn)象,，為進一步改善反應(yīng)物擴散和酶可及性問題，團隊嘗試在反應(yīng)器核心中設(shè)計通道,。初步固定通道寬度為24 μm,，改變反應(yīng)器核心的壁厚度（24 μm - 480 μm），觀察到壁厚從480 μm減小到24 μm時，比活性提高約40%,，其中壁厚度小于100 μm 時提升尤為顯著,。而這一尺度是傳統(tǒng)3D打印難以實現(xiàn)的，再次證明PμSL技術(shù)運用于該類結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)優(yōu)勢,。實驗觀察到合成速率并未隨壁厚度減小而顯著增加,，這是因為減小壁厚度雖縮短了擴散路徑提高了合成速率，但也減少了酶的總質(zhì)量,，二者存在權(quán)衡關(guān)系,。進一步的研究表明，固定壁厚度為24 μm,，改變通道寬度（24 μm- 96 μm）時,，比活性增加15%，原因是較大通道利于熱對流,，使底物更快到達水凝膠中心,，從而增加了底物與酶的接觸機會。然而,，合成速率卻下降了43%,，主要原因為通道尺寸增大導(dǎo)致打印水凝膠體積減小，進而使得酶質(zhì)量隨之減少,。

綜合實驗結(jié)果,，為了最大化比活性，采用薄通道壁和大孔隙組合可使比活性提高60% ,，但就會導(dǎo)致在流動條件下大孔隙重要性降低,。而對于小型反應(yīng)器核心而言，較小孔隙和增加酶質(zhì)量更利于提高合成速率,。此外,，分析表明比活性和合成速率與宏觀表面積相關(guān)性較差，高分辨率3D打印可精確控制分子在水凝膠中擴散的最大路徑長度,，進而優(yōu)化生物催化反應(yīng)器性能,。

圖3. 通過改變通道尺寸和壁厚提高反應(yīng)器核心的效率。a）增加3D打印立方體的尺寸導(dǎo)致比活度（b）和合成速率（c）均下降,。水凝膠立方體的尺寸范圍為L=1.25至2.0 mm,，并含有嵌入的β -Gal。d ）將通道間壁厚從w=480降低至24 μm,，可使反應(yīng)器核心效率提高約50%,，比活性變化結(jié)果如（e）所示，合成速率（f）在此范圍內(nèi)略有增加,。立方體尺寸固定在L=2.0 mm,，孔徑固定在24 μm,。g ）將通道寬度從p=24增加至96 μm，提升反應(yīng)器核心效率,，如比活性（h）的結(jié)果,，但合成速率降低（i）。誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差 (sem),，各重復(fù)三次,。

接下來，團隊設(shè)計并打印了一套完整的連續(xù)流反應(yīng)器,。組裝完成后,，研究人員先以50 μL/min 的流速將500 μL反應(yīng)物溶液注入反應(yīng)器，并重復(fù)9次循環(huán),。實驗初期,，由于反應(yīng)器需要時間建立穩(wěn)定的反應(yīng)物和產(chǎn)物流動狀態(tài)，輸出的比活性較低（0.16 μmol·min-1·mg-1）,。但隨著循環(huán)次數(shù)的增加,，反應(yīng)器逐漸達到穩(wěn)態(tài)，比活性也逐漸升高,，最終達到約0.8 μmol·min-1·mg-1并趨于穩(wěn)定,。

在比活性穩(wěn)定后，文章進一步探究流速對反應(yīng)器性能的影響,�,？刂屏魉僭� 25-1000 μL/min 范圍內(nèi)并保持500 µL的反應(yīng)物總量。實驗結(jié)果表明比活性隨著流速的增加而不斷提高,。當(dāng)最高流速1000 μL/min時,，比活性達到 7.0 μmol·min-1·mg-1，相比靜態(tài)實驗中獲得的最高比活性提高了200% 以上,，且有效因子達到64%,。這一結(jié)果與前期文獻中使用的3D擠出法（<7%）和3D噴射法（21.2%）的結(jié)果相比,，有顯著的提升,。合成速率也呈現(xiàn)出隨流速增加而上升的趨勢。在流速為1 mL/min 時,，合成速率達到最大值0.29 μg·min-1·mm-3,，相比靜態(tài)實驗提高了240%。綜上所述,，在低轉(zhuǎn)化率下,，比活性/合成速率與流速呈線性比例關(guān)系，由于底物在主體流動中的濃度相對穩(wěn)定,，流速成為控制合成速率的關(guān)鍵因素,。但仍存在大量試劑未反應(yīng)就流過通道的問題,。這也表明當(dāng)前反應(yīng)器在底物利用效率方面還有提升的空間。

圖4. 完全3D打印的連續(xù)生物催化流動反應(yīng)器,。a）流動反應(yīng)器裝置示意圖,。使用注射泵可以實現(xiàn)可控流速將底物分子注入 3D 打印生物催化反應(yīng)器。溫度由設(shè)定值控制的水浴槽精確控制,。b）流動反應(yīng)器的放大示意圖,，顯示了反應(yīng)器核心內(nèi)嵌入的反應(yīng)酶（β-半乳糖苷酶）。當(dāng)?shù)孜颫NPG流過反應(yīng)器核心時,，會得到產(chǎn)物半乳糖和 ONP,。c）流動反應(yīng)器外殼的CAD文件，其中箭頭表示流動方向,。d） CAD文件顯示了集成反應(yīng)器核心與反應(yīng)器外殼的結(jié)構(gòu),。e） 3D打印產(chǎn)出的反應(yīng)器核心（PµSL）集成到3D打印反應(yīng)器外殼（AnyCubic）中。f） β-半乳糖苷酶的比活性在重復(fù)循環(huán)后起初表現(xiàn)出增加趨勢,，然后開始走向平穩(wěn),，其循環(huán)周期為兩小時。g）1 次循環(huán)是 500 µL反應(yīng)溶液以 50 µL/min的速率注入,。h）流速增加,，比活性和合成速率也增加。

總結(jié)：該研究運用高精度面投影微立體光刻 (PμSL) 3D 打印技術(shù),，打印高分辨率 (10 μm),、高保真、酶活性水凝膠反應(yīng)器核心,。相較于無通道的3D打印部件,，該結(jié)構(gòu)成功將比活性提升60%，在小于100 μm 尺度實現(xiàn)效率突破,，證明高分辨率3D打印可優(yōu)化反應(yīng)器性能,。同時，構(gòu)建的3D打印連續(xù)生物催化流動反應(yīng)器性能突出,。在最高流速下合成速率相比靜態(tài)實驗提升240%,，有效因子達64%。并且,，小型反應(yīng)器理論的時空產(chǎn)率較好,，滿足商業(yè)高價值產(chǎn)品生產(chǎn)要求，若能放大規(guī)模,，有望推動藥物制造向更可持續(xù)的方向發(fā)展,，為生物催化領(lǐng)域帶來新的突破。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ces.2024.121156