寧波大學(xué)團隊：水凝膠犧牲模板法結(jié)合3D打印定制具有通道網(wǎng)絡(luò)的支架材料

來源： EFL生物3D打印與生物制造

基于水凝膠的3D打印是一種精確制造復(fù)雜細胞結(jié)構(gòu)的快速方法。然而,，生物活性水凝膠的機械性能較弱，在直接打印過程中,，這些具有通道網(wǎng)絡(luò)的水凝膠結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定,。因此，要制造具有通道網(wǎng)絡(luò)的良好結(jié)構(gòu),，必須選擇合適的水凝膠并開發(fā)有針對性的制造方法,。基于此,，來自寧波大學(xué)的金育安教授聯(lián)合寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)與生物工程研究所的邵磊副研究員開發(fā)了一種基于商用3D打印機和水溶性聚乙烯醇(PVA)構(gòu)建有效水凝膠通道網(wǎng)絡(luò)的模板犧牲3D打印方法,。利用這種3D打印技術(shù)制備并培養(yǎng)了不同通道網(wǎng)絡(luò)密度的負載細胞的GelMA構(gòu)建體，實驗結(jié)果表明通道網(wǎng)絡(luò)密度越高,，細胞生長越好,，這表明相互連接的通道網(wǎng)絡(luò)加速了氧/營養(yǎng)物的供應(yīng)，促進了細胞生長,。相關(guān)研究成果以“3D printing sacrificial templates for manufacturing hydrogel constructs with channel networks”為題發(fā)表在《Materials & Design》上,。

圖1 水凝膠3D打印犧牲模板路線示意圖

具體來說，首先使用3D打印機將PVA打印為犧牲模板。然后澆鑄GelMA溶液以包封犧牲模板,，并進行光致交聯(lián),。最后，犧牲模板被溶解以形成通道網(wǎng)絡(luò),。作為犧牲材料,，PVA具有幾個優(yōu)點，i)友好的溶解速率便于后期的澆鑄操作,；ii) 印刷 PVA 細絲的高圓度導(dǎo)致通道網(wǎng)絡(luò)的高圓度,；iii) PVA犧牲模板具有高穩(wěn)定性和長期保存性，便于運輸,、流通和使用,。

1. 印刷速度和細絲/通道直徑之間的關(guān)系
由于通道直徑和通道密度對營養(yǎng)物/氧氣傳輸有很大影響，因此作者首先研究了印刷速度對PVA細絲/通道直徑的影響,，以及PVA犧牲模板的填充速率,。實驗中構(gòu)建了一個單層結(jié)構(gòu)，通過改變印刷速度來實現(xiàn)直徑梯度,。從實際印刷中可以看出,，印刷的單層結(jié)構(gòu)具有明顯的直徑梯度，相應(yīng)的通道也具有明顯的直徑梯度（圖2）,。在溶解PVA犧牲模板的過程中,，PVA細絲會膨脹，從而增加通道尺寸和整個結(jié)構(gòu)的營養(yǎng)/氧氣滲透性,。

圖2 印刷速度和細絲/通道直徑之間的關(guān)系

2. 具有不同通道網(wǎng)絡(luò)支架的營養(yǎng)傳輸能力
通過改變PVA犧牲模板的填充率,，可以很容易地制備出具有不同通道網(wǎng)絡(luò)密度的水凝膠結(jié)構(gòu)（圖3a）。同時,，為了驗證不同通道網(wǎng)絡(luò)的營養(yǎng)傳輸能力,，在這些具有不同通道網(wǎng)絡(luò)密度的GelMA支架上進行營養(yǎng)傳輸實驗。具體來說,，我們將紅色染料注入支架的第一層,，觀察營養(yǎng)物質(zhì)的流動和擴散（圖3b）。染料流動和擴散實驗表明,，整個營養(yǎng)物網(wǎng)絡(luò)是相互連接的,，營養(yǎng)物擴散能力隨著通道網(wǎng)絡(luò)密度的增加而增加，這保證了整個結(jié)構(gòu)能夠得到營養(yǎng)物/氧氣的充分供應(yīng),。

為了研究不同結(jié)構(gòu)的機械強度,，為不同組織的制造提供強度參考，進行了壓縮實驗以表征不同通道網(wǎng)絡(luò)密度的結(jié)構(gòu)的機械性能,。隨著通道網(wǎng)絡(luò)密度的增加,，結(jié)構(gòu)強度下降，這些結(jié)構(gòu)的壓縮模量約為1.1 ~ 3.6 kPa，可以滿足一些軟組織制造要求（圖3c-d）,。

圖3 不同通道網(wǎng)絡(luò)支架的傳輸能力

3. 支架通道的保真度
為了觀察通道的保真度,，將結(jié)構(gòu)縱向切開，然后在光學(xué)顯微鏡下對切片成像（圖4a）,。通道的圓形保真度隨著填充率的增加而降低,。這是由兩個原因造成的:i)當(dāng)PVA細絲致密時，在溶解過程中細絲膨脹會導(dǎo)致通道變形,，從而導(dǎo)致通道保真度低；ii)當(dāng)通道非常密集時,，構(gòu)造的機械性能較弱,，將直接導(dǎo)致通道更容易受重力的影響而變形。

隨著填充率的增加,，通道的保真度下降,，當(dāng)填充率超過15%時，保真度急劇下降,。此外,，犧牲模板的縱剖面顯示細絲具有較高的圓整度，相鄰層的細絲相互連通,，為構(gòu)建連通的通道網(wǎng)絡(luò)提供了保證（圖4c）,。溶解PVA模板后，縱向截面圖像顯示相鄰層的通道相互連接以促進營養(yǎng)物/氧氣的輸送（圖4d）,。

圖4 支架通道的保真度

4. 用于構(gòu)建基于水凝膠的血管芯片
為了證明制造基于水凝膠的芯片的能力,，作者制造了具有不同分布的單層通道結(jié)構(gòu)（圖5a）。具體地,，澆注時,，先在模具底部覆蓋一層37 ℃的GelMA溶液，在4 ℃下冷卻5分鐘,，使其輕微熱交聯(lián)至微粘狀態(tài),。然后將單層犧牲結(jié)構(gòu)放置在輕微熱交聯(lián)的GelMA上，并用液體GelMA溶液封裝,。最后,，整個結(jié)構(gòu)光交聯(lián)15 s，借助石蠟?zāi)�從模具中分離,，隨后浸入37 ℃的介質(zhì)中,。2小時后，大部分PVA細絲溶解,，剩余的PVA用PBS洗滌,。

圖5 用于構(gòu)建基于水凝膠的血管芯片的示意圖

為了驗證我們的方法可以構(gòu)建自由形式的基于水凝膠的血管芯片，印刷不同形狀的PVA犧牲模板用于制造自由形式的通道圖案，包括三角形,、四邊形,、五角形、六邊形等,。用染色的PBS溶液灌注證明了通道的可行性,，表明其在制造自由形式通道圖案的策略在血管芯片上具有非常可行的應(yīng)用潛力,。

5. 通道網(wǎng)絡(luò)對細胞活性的影響
之后,，作者進一步制造并培養(yǎng)了具有不同通道網(wǎng)絡(luò)密度的細胞負載構(gòu)建體。如圖6所示,，通道邊界清晰,，隨著進一步培養(yǎng)，細胞逐漸拉伸連接形成網(wǎng)絡(luò),。通道網(wǎng)絡(luò)密度越高,，細胞間的連接越緊密，表明營養(yǎng)/氧輸送能力隨著通道密度的增加而增加,。

圖6 通道網(wǎng)絡(luò)密度對細胞密度的影響

此外,，培養(yǎng)1天后，使用鈣黃綠素(AM)和碘化丙錠(PI)通過活/死染色來評估細胞的存活力（圖7a）,�,；�/死圖像表明細胞均勻地分布在建筑物中，具有高的生存能力,，證實了具有高通道網(wǎng)絡(luò)密度的結(jié)構(gòu)可以提供更充足的養(yǎng)分/氧氣,。為了有效評估通道網(wǎng)絡(luò)可促進細胞生長和遷移，在培養(yǎng)一段時間(第3,、7和10天)后,，對細胞形態(tài)進行表征和成像，細胞逐漸擴散并連接成網(wǎng),，同時逐漸向通道遷移(紅色箭頭所示)（圖7c）,。

圖7 細胞活力及其細胞形態(tài)

綜上， 本文提出了一種基于3D打印機和PVA的犧牲模板技術(shù)來構(gòu)建有效的水凝膠通道網(wǎng)絡(luò),。商用PVA耗材是水溶性的,，溶解時間便于操作，并且商業(yè)PVA細絲的高機械強度確保了復(fù)雜犧牲模板的構(gòu)造,。另外,，PVA耗材穩(wěn)定性好，可長期保存,，便于犧牲模板的批量制造,、運輸,、流通和使用。研究證明,，利用模板犧牲的3D打印方法能夠制造出的具有通道網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)支架,，可以促進細胞擴散、增殖和遷移,，同時保持其高活性,。這種以PVA為犧牲耗材的支架構(gòu)造技術(shù)為三維細胞培養(yǎng)和高生物活性組織制造提供了一種實用的方法。

文章來源：https://doi.org/10.1016/j.matdes.2022.111012