南京工業(yè)大學(xué)CEJ——3D打印酶固定化流動(dòng)反應(yīng)器高效去除牛奶乳糖

來(lái)源：材料人

牛奶含有人體必需的微量營(yíng)養(yǎng)素,，對(duì)人們平衡膳食至關(guān)重要,。然而,，乳糖不耐癥患者在攝入含有乳糖的牛奶后,，由于腸道中缺乏水解乳糖的乳糖酶,，會(huì)出現(xiàn)腹脹,、腹瀉和腸胃痙攣,。盡管現(xiàn)在食品工業(yè)通過(guò)膜分離、超濾和添加游離β-半乳糖苷酶等方法實(shí)現(xiàn)了低乳糖和無(wú)乳糖牛奶的生產(chǎn),，然而生產(chǎn)工藝復(fù)雜和生產(chǎn)過(guò)程中資源浪費(fèi)導(dǎo)致其低成本效益,。其中β-半乳糖苷酶將乳糖分水解為葡萄糖和半乳糖，高效水解牛奶乳糖的同時(shí)不影響牛奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,。因此,，一種高效，操作穩(wěn)定和安全的 β-半乳糖苷酶固定化方法用于低乳糖和無(wú)乳糖牛奶的生產(chǎn)具有重要意義,。

為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo),，南京工業(yè)大學(xué)何冰芳教授高兵兵副教授開(kāi)發(fā)出一種3D打印β-半乳糖苷酶流動(dòng)反應(yīng)器用于低乳糖和無(wú)乳糖牛奶的生產(chǎn)（圖1）。通過(guò)聚乙烯亞胺和透明質(zhì)酸鈉層的層層自組裝快速修飾3D打印聚乳酸支架簡(jiǎn)化酶固定化載體修飾過(guò)程,，京尼平作為交聯(lián)劑共價(jià)固定了β-Gal保證高效,、穩(wěn)定地固定酶。此外,，集成到流動(dòng)反應(yīng)器中的3D打印支架通過(guò)定向通道擾動(dòng)了不同反應(yīng)器中的流體,，改善了內(nèi)部傳質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)了高效的牛奶乳糖水解,。該反應(yīng)器酶固定化效率高,，催化活性穩(wěn)定，在低乳糖和無(wú)乳糖牛奶生產(chǎn)及其他生物催化領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景,。相關(guān)成果發(fā)表在國(guó)際頂級(jí)期刊Chemical Engineering Journal 雜志上（影響因子15.1）,。論文第一作者為南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院碩士研究生邵云，通訊作者為南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院的何冰芳教授以及高兵兵副教授,。研究工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃,、國(guó)家自然科學(xué)基金,、江蘇省自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的資助。

圖1. 用于高效低乳糖和無(wú)乳糖牛奶生產(chǎn)的3D打印β-半乳糖苷酶流動(dòng)反應(yīng)器

在本研究中,，研究人員制作內(nèi)部具有定向通道和孔隙的3D打印聚乳酸支架（圖2）,。與傳統(tǒng)的酶固定化載體如微納米粒子、水凝膠等相比,，3D打印支架可以更簡(jiǎn)便的和流動(dòng)反應(yīng)器相結(jié)合而不用考慮管道堵塞和壓實(shí)的問(wèn)題,。此外，聚乙烯亞胺和透明質(zhì)酸鈉層層自組裝修飾3D打印支架簡(jiǎn)化酶固定化載體修飾過(guò)程,。

圖2. 3D聚乳酸支架以及聚乙烯亞胺和透明質(zhì)酸鈉層層自組裝修飾過(guò)程

此外,，京尼平作為一種交聯(lián)劑，目前已被廣泛研究用于高效共價(jià)連接酶分子和改性載體支架,，更重要的是,，它的細(xì)胞毒性比傳統(tǒng)交聯(lián)劑戊二醛低 5,000-10,000 倍。在酸性條件下,，β-半乳糖苷酶的伯氨基進(jìn)攻京尼平的 C3,，打開(kāi)二氫吡喃環(huán)，形成芳香族氨基,。研究人員通過(guò)條件優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了β-半乳糖苷酶的高效固定和穩(wěn)定的固定化酶性質(zhì)（圖3）,。

圖3. 固定化條件優(yōu)化和固定化酶學(xué)性質(zhì)研究

同時(shí)，研究人員將3D打印β-半乳糖苷酶支架和流動(dòng)反應(yīng)器相結(jié)合,，通過(guò)設(shè)計(jì)不同的支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)研究流體擾動(dòng)對(duì)于酶和底物傳質(zhì)影響,。此外，還通過(guò)COMSOL模擬進(jìn)一步研究流體在反應(yīng)器內(nèi)部分布,。集成到流動(dòng)反應(yīng)器中的3D打印支架通過(guò)定向通道擾動(dòng)了不同反應(yīng)器中的流體,，改善了內(nèi)部傳質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)了高催化活性（圖4）,。

圖4. 3D打印β-半乳糖苷酶流動(dòng)反應(yīng)器的乳糖水解性能

此外,，傳統(tǒng)的載體改性采用化學(xué)方法枝接官能團(tuán)，一旦官能團(tuán)被占據(jù),，再改性是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,。而逐層自組裝改性可以依靠載體表面的氫鍵或離子相互作用，方便快捷地反復(fù)枝接的官能團(tuán),，用于固定化酶,。逐層自組裝修飾的3D打印聚乳酸支架可以循環(huán)重復(fù)使用，固定β-半乳糖苷酶,，只需在被固定的酶失去酶活性后將其收集起來(lái),，重新自組裝修飾固定酶即可（圖5a）。

圖5. 層層自組裝修飾載體重復(fù)利用