香港城市大學胡金蓮院士《AFM》：重組蜘蛛蛋白水凝膠用于生物3D打印和仿生細胞支架

來源： EngineeringForLife

重組蜘蛛蛋白為創(chuàng)造新的生物材料提供了許多可能性,。然而,，它們的多態(tài)性和易于聚集的特性在其生產(chǎn)和實際應用中都提出了挑戰(zhàn),。香港城市大學胡金蓮院士及其團隊報道,，突變重組蜘蛛蛋白在37°C和可見光照射下可快速,、可控地形成水凝膠,。在突變蜘蛛蛋白中，苯丙氨酸殘基（F）被（GGX）重復序列中的酪氨酸殘基（Y）取代,，這有助于β-sheet的自組裝和進一步形成淀粉樣納米原纖維,。膠束/球狀蜘蛛蛋白溶液轉(zhuǎn)化為由納米原纖維網(wǎng)絡組成的蜘蛛蛋白水凝膠,，隨后通過雙酪氨酸進一步交聯(lián)。通過光譜學,、透射電子顯微鏡（TEM）和分子動力學模擬驗證其構(gòu)象轉(zhuǎn)變過程,。此外，蜘蛛蛋白水凝膠根據(jù)其良好的生物相容性,、剪切減薄性能和納米原纖維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu),，被用作生物墨水和仿生細胞支架。本研究結(jié)果揭示了蜘蛛蛋白的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化機制,，并擴展其在生物醫(yī)學工程中的應用,。

相關研究內(nèi)容以“Rapidly Forming Recombinant Miniature Spidroins Hydrogels Composed of Nanofibrils with Tunable Mechanical Properties for Bio 3D Printing and Biomimetic Cellular Scaffolds”為題于2024年12月26日發(fā)表在《Advanced Functional Materials》上。  

圖1 工程重組微型蜘蛛蛋白示意圖及其水凝膠形成機理

圖2 蛋白質(zhì)表達與分子動力學計算   

圖3 水凝膠的制備和結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的表征

與蜘蛛蛋白相比,，M-蜘蛛蛋白在凝膠形成過程中更容易從膠束/球中轉(zhuǎn)化為β-sheet和淀粉樣納米原纖維,，并可以通過雙酪氨酸進一步交聯(lián)（圖1c-e）。為了保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性,，本研究進行了一個保守突變,，用酪氨酸（Y）取代MaSp2中的苯丙氨酸（F），設計的蜘蛛蛋白和突變蜘蛛蛋白的核心結(jié)構(gòu)域序列如圖1a所示,。微型MaSp2由329個氨基酸組成,，其中MaSp2結(jié)構(gòu)域的一個重復區(qū)域位于NT和CT的兩側(cè)（圖1b）。

設計的蛋白質(zhì)由大腸桿菌（E. coli）生產(chǎn),，通過固定化金屬親和層析（IMAC）和尺寸排斥色譜柱進一步純化,，并通過SDS-PAGE進行表征（圖2a）。蜘蛛蛋白和突變蜘蛛蛋白制劑的蛋白產(chǎn)率分別為116 ± 14和121±24mg L−1,。由于突變,，范德華力和靜電相互作用更強，蛋白質(zhì)傾向于自組裝（圖2e）,。蜘蛛蛋白/M-蜘蛛蛋白水溶液可以在37℃下快速形成水凝膠,，并通過藍光進一步交聯(lián)（圖3a、b）,。為研究蜘蛛蛋白在凝膠化過程中的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化,，首先采用圓二色性（CD）。如圖2b所示,，M-蜘蛛蛋白/蜘蛛蛋白的CD光譜顯示,，在208和223 nm處出現(xiàn)強峰，表明蛋白質(zhì)在所有溫度下的構(gòu)象主要是α-螺旋和隨機螺旋結(jié)構(gòu),。隨著溫度從10°C增加到70°C，兩種蛋白開始展開螺旋,，β-sheet的含量從4.15增加到17.61%（圖2c）,。蜘蛛蛋白和M-蜘蛛蛋白在4°C和37 °C水溶液中的快照如圖2d,、e所示。此外,，還計算了不同溫度下蜘蛛蛋白和M-蜘蛛蛋白中2個REP區(qū)域之間的定向平均相互作用自由能（圖2f,、g）。為深入了解M-蜘蛛蛋白/蜘蛛蛋白的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換過程,，應用FTIR和XRD光譜對二級結(jié)構(gòu)進行定量訪問（圖3c-j）,。M-蜘蛛蛋白和蜘蛛蛋白在水溶液中都以直徑為25 nm的球狀或膠束的形式存在（圖3k）。在37°C孵育1小時后,，蜘蛛蛋白轉(zhuǎn)化為淀粉樣納米原纖維并形成水凝膠（圖3l,、m）。交聯(lián)的M-蜘蛛蛋白水凝膠表現(xiàn)為更長,、更薄的納米原纖維的聚集物（圖3n）,。   

圖4 水凝膠的力學性能

滲透斜坡實驗表明，蜘蛛蛋白和M-蜘蛛蛋白溶液的存儲模量均隨溫度的升高而增加,，而隨著溫度降低,，存儲模量沒有下降到之前的值，但仍高于損失模量（圖4a）,，表明形成一種熱不可逆,、穩(wěn)定的水凝膠。此外,，M-蜘蛛蛋白溶液可以在可見光控制下的2 min內(nèi)形成水凝膠（圖4b）,。從SEM圖像中觀察到水凝膠的孔隙大小約為10μm（圖4c、d）,。在恒定頻率為1rad s−1下進行的振蕩振幅掃描顯示,，這些水凝膠樣品在0.1-5%的應變范圍內(nèi)具有彈性。然而,，當?shù)鞍踪|(zhì)濃度從150mg下降到50 mg mL−1時,，線性粘彈性區(qū)域從9%轉(zhuǎn)移到3%（圖4e）。通過控制蛋白質(zhì)的濃度,，可以很容易調(diào)整水凝膠的機械強度（圖4f）,。與本研究結(jié)果相比，之前報道的凝膠化時間更長,，凝膠化溫度明顯更高,，并且所得到的水凝膠通常不透明（圖4g）。

圖5 蜘蛛蛋白水凝膠作為生物墨水和細胞支架的演示

本研究進一步證明了M-蜘蛛蛋白適用于生物技術應用（圖5）,。采用振蕩剪切流變學分析方法,，對M-蜘蛛蛋白/蜘蛛蛋白水凝膠在交聯(lián)前的可打印性進行評價。所有濃度的水凝膠都表現(xiàn)出剪切變薄行為（圖5a）,。高應變振蕩（200%）使水凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)楦�具粘性的狀態(tài)（圖5b）,�,；�于剪切稀釋和恢復性能，M-蜘蛛蛋白/蜘蛛蛋白水凝膠適用于3D打印,，因此打印了支架,，并根據(jù)針的尺寸、打印速度和壓力等優(yōu)化打印條件（圖5c,、d）,。用小鼠胚胎纖維母細胞評價M-蜘蛛蛋白生物墨水的細胞活力和增殖能力。與商用的絲素纖維蛋白生物墨水相比（圖5e-g）,，M-蜘蛛蛋白生物墨水具有更高的活力（>95%）,，并與絲素生物墨水一樣增殖。然后將M-蜘蛛蛋白與人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）混合,，采用不同的處理方法制備生物墨水,。四個小塊和一個水凝膠的“CITYU”圖案通過可見光固化（圖5h）�,！癈ITYU”水凝膠用CD31和Hoechst染色（圖5i）,。用Calcein/PI染色，共聚焦顯微鏡觀察兩種圖案水凝膠,。由于納米纖維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu),，培養(yǎng)5天后觀察到90%以上的細胞活力（圖5j）。對于生物3D生物打印,，將細胞裝入M-蜘蛛蛋白溶液中,，在擠壓前以37°C孵育60分鐘，該支架由機械臂打印,，并通過藍光進一步固化（圖5k）,。免疫染色分析的結(jié)果證實HUVECs在第7天表達CD31（圖5i-m）。以上結(jié)果表明,，M-蜘蛛蛋白兼容不同的模式方法,，并支持細胞的生長和增殖。   

全文小結(jié)
綜上所述,，本研究制備了一種基于結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的微型重組蜘蛛蛋白水凝膠,，可應用于生物3D打印和細胞支架。揭示了凝膠化過程中蜘蛛蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變的機理,，并通過CD,、FTIR、XRD譜,、TEM和理論計算進行驗證,。高濃度的M-蜘蛛蛋白（膠束結(jié)構(gòu)）可轉(zhuǎn)化為淀粉樣納米原纖維，誘導水凝膠形成，并可通過雙酪氨酸進一步交聯(lián),。因此,，M-蜘蛛蛋白可以非常迅速地形成水凝膠,，交聯(lián)水凝膠表現(xiàn)出可調(diào)的力學性能,。此外，本研究還展示了M-蜘蛛蛋白作為生物墨水進行3D打印的應用,，以及與ECM相似的納米纖絲網(wǎng)絡結(jié)構(gòu),，可以促進細胞增殖。由結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化衍生而來的M-蜘蛛蛋白水凝膠的概念為創(chuàng)建具有先進特性的功能化水凝膠提供可能性,，可用于廣泛的應用,，如酶的錨定、可控藥物釋放和組織工程,。

文章來源：
https://doi.org/10.1002/adfm.202420059